氨基酸分析样品的水解处理

氨基酸分析样品水解用于氨基酸分析的样品制备要得到满意的氨基酸分析结果，不仅仅要注意样品的制备，最重要的是样品的处理。最精密的仪器也只是在分析时从样品中分离出氨基酸本来的含量。下面的制备方法已经过实践验证，适用于常规分析。但在某些情况下也可以，或者说有必要，做适当的修改。含缩氨酸或蛋白质的样品制备方法：水解样品需要预先粉碎并过60目筛，如果样品含有油脂成分，则水解前还必须先萃取。方法一、用6mol/L盐酸水解纯蛋白质或缩氨酸1、称取含蛋白7.5-25mg的样品（约50－100mg，准确至0.1mg）于20mL安培管中（切勿粘壁）；2、加入10mL6mol/LHCL（取500mL优级纯盐酸（36-38%），定容到1000mL，加1g苯酚）；3、用液氮冷冻；4、待液体超过三分之一凝固后，抽真空，熔化安培管使其密封；5、根据样品的不同，将其放在110℃的炉子（烘箱）上，水解12、24、36或72h；6、为了保证结果的重现性，应使炉子恒定在110℃，建议使用内置气流环路的炉子；7、水解完成后，冷却，混匀，开管，过滤，定容至50mL；8、取适量（0.5mL左右）滤液置于浓缩仪或旋转蒸发仪中，低于60℃，抽真空，蒸发至干，必要时加少许水，重复蒸干1－2次；9、加入1－3mL样品稀释液，使氨基酸浓度达到50－250nmol/mL。震荡混匀，用0.22μm滤膜过滤后，供上机测定使用。注意：称取样品的量最好与氮的总含量相关联，这样分析结果的重复性会更好。除此之外的另一个重要因素是样品量与所加入的酸的比例。当样品中不含纯的缩氨酸和蛋白质而是含有碳水化合物时，酸的多少就非常重要。碳水化合物的量越多，所需酸就越多。样品与酸的比例必须在1:10到10:1的之间(mg/mL)。方法二、氧化水解1、称取含蛋白7.5-25mg的样品（约50－100mg，准确至0.1mg）于20mL浓缩管中（切勿粘壁）；2、置于0℃冰水中加入2mL预冷的过甲酸溶液，加液时需将样品全部润湿，但不能摇动；3、在2℃的冰箱中放置15h；或者55℃水浴中放置15min；4、溶液中多余的过甲酸可以通过加入氢溴酸（48％氢溴酸0.3mL）放入冰浴静止30min来去除；5、然后置于浓缩仪或旋转蒸发仪中，低于60℃，抽真空，蒸发至干；6、用10-15mL6mol/LHCL将残渣转移到20mL安培瓶或厌氧管中（切勿粘壁），封口（无须抽真空），置于（110±1）℃恒温干燥箱中水解22－24h；7、水解完成后，冷却，混匀，用水把水解液定容到20mL；8、过滤后取0.5mL上清液浓缩至干；9、加入1－3mL样品稀释液，使氨基酸浓度达到50－250nmol/mL，震荡混匀，用0.22μm滤膜过滤后，供上机测定使用。注意：在氧化过程中，酪氨酸将被完全破坏，而组氨酸被部分破坏；制备过甲酸（过蚁酸）溶液（过甲酸溶液必须在每次使用时制备）：过甲酸溶液：30％H2O2和88%甲酸按1：9（V/V）混合，于室温下放置1h，置于0℃冰水中冷却30min，临用前配置。方法三、碱水解1、称取含蛋白7.5-25mg的样品（约50－100mg，准确至0.1mg），置于聚四氟乙烯衬管中；2、加入4mol/LLiOH1.5mL；3、然后在液氮中冷冻，待液体完全凝固后将衬管插入水解玻璃管中；4、抽真空至≤7Pa后封口；5、将封好口的水解管放入（110±1）℃恒温干燥箱中，水解20h；6、冷却，混匀，开管；7、用样品稀释液pH4.3将内容物定量地转移至10mL或25mL容量瓶中；8、用6mol/L的HCL约1mL中和，并用样品稀释液pH4.3定容；9、用0.22μm的过滤器过滤溶液，供上机测定使用。注意：相对于酸水解而言，碱水解时破坏的氨基酸要多很多，但酸水解会被破坏的色氨酸在碱水解时却能保持稳定，因此碱水解就是用以分离色氨酸，通常会使用氢氧化钡，这样水解之后就必须用CO32-或SO42-来沉淀钡离子，而且氨基酸可能会因为沉淀盐的吸附而损失，亮氨酸在碱水解和酸水解过程中都很稳定，它可以用来检查这种吸附产生的损失。