水生生物分子生物学

第二章核酸的结构(一)DNA的结构1.一级结构：DNA分子中核苷酸通过3’，5’-磷酸二酯键连接的排列顺序。2.二级结构（双螺旋）：两条单链DNA通过碱基互补配对的原则形成的双螺旋结构。影响双螺旋结构稳定性的因素：氢键；磷酸酯键；碱基堆积力(非特异性结合力)；碱基内能；磷酸基团间的静电斥力3.A,B和Z型DNA的结构：B-DNA，右手双螺旋，细胞内最稳定、最常见的构象；A-DNA，右手双螺旋，存在于脱水DNA，DNA-RNA杂交分子，双链RNA；Z-DNA，左手双螺旋，与基因的表达调控有关4.反向重复序列反向重复（回文序列）：指在双链DNA中某些区段含有两个结构相同、但方向相反的序列。1)较长的回文结构，可形成茎环结构(发夹结构)或十字形结构；2)较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性内切酶的识别位点。三股螺旋DNA由一条寡核苷酸链通过与双链DNA形成Hoogsteen键，在其大沟处紧密缠绕而成。无论何种形式的三螺旋DNA,中间链必须是Purin链PU+PU/PY(偏碱性介质中稳定)；PY+PU/PY(偏酸性介质中稳定)常见类型（二）DNA的变性、复性DNA变性（DNADenaturation）：双螺旋DNA溶解成单链的现象，也称溶解。DNA复性（DNARenaturation）：变性DNA在一定条件下重新恢复双链的过程，也称退火（Anneal）。变性过程的表现：S.S.DNA粘度降低；S.S.DNA沉降速度加快；S.S.DNA分子的A260nmUV值上升1.增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，紫外吸收(260nm)值增大。DNA变性后增加25－40%减色效应：在DNA的复性过程中，紫外吸收(260nm)值减小。而RNA变性后，约增加1.1%2.Tm(meltingtemperature)：使DNA双螺旋结构解开一半的链时的温度。影响Tm值的因素即影响DNA变性生物因素：1)在A,T,C,G随机分布的情况下：GC%愈高，Tm值愈大；GC%愈低，Tm值愈小2)GC%含量相同的情况下：AT形成变性核心，变性加快，Tm值小3)片段的长度：4)变性剂（如尿素，酰胺等）：5)介质中的离子强度：离子强度高，Tm高6)极端pH条件的影响：一切减弱氢键，碱基堆积力的因素均将使Tm值降低3.DNA分子的复性(annealorrenaturation)复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞影响DNA复性过程的因素：1)阳离子浓度：0.18~0.2MNa+可消除polydNt间的静电斥力2)温度：复性反应的温度Tm-25℃3)S.S.DNA分子长度：S.S.DNA愈长/短，分子扩散愈慢/快，复性愈慢/快4)S.S,DNA的初始浓度：5)DNA分子中,dNt的排列状况(随机排列,重复排列)4.核酸的杂交亲缘关系相近的不同来源DNA单链或DNA单链与RNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程称为分子杂交常用的核酸分子杂交：A.Southern杂交（DNA+DNA）:Southern于1975年建立，将DNA固定在滤膜上，用标记好的同位素DNA探针与之杂交，通过放射自显影显示与探针互补的区带，识别特异序列。B.Northern杂交(RNA+DNA):研究对象是mRNA，探针一般是DNA。将RNA固定在滤膜上，用DNA探针与之杂交。C.Western杂交(蛋白质＋蛋白质):抗原与抗体的杂交,研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术D.原位杂交（insitubloting）:利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术RNA的结构mRNA：messengerRNA占细胞总RNA的5%左右，含量最少，代谢活跃。mRNA在蛋白质的生物合成中起模板作用。tRNA：transferRNA占细胞总RNA的15%左右。是结构研究最清楚的一类RNA。在蛋白质的生物合成中，tRNA起携带氨基酸的作用。rRNA：ribosomalRNA占细胞中总RNA80%左右。大肠杆菌rRNA中有三种:16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA；真核细胞rRNA中有四种，28SrRNA、18SrRNA、5.8SrRNA、5SrRNA。核糖体是蛋白质合成的场所小分子RNA核不均一RNA（hnRNA）、核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA、反义RNA（asRNA）,胞质小RNA(scRNA)原核生物mRNA结构特点：1、多顺反子（polycistron）:一分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息，可以作为几种蛋白质的模板，能翻译出几种蛋白质。2、mRNA5′端无帽子结构,3′端一般无多聚A的尾巴。3、一般没有修饰碱基。真核生物mRNA结构的特点1、5′末端有帽子结构。2、3′端多数带有多聚A的尾巴3、分子中可能有修饰碱基,主要是甲基化.4、分子中有编码区与非编码区。非编码区（untranslatedregionUTR）位于编码区的两端；5′非编码区有翻译起始信号。tRNA：转运氨基酸1、单链小分子，含73~93个核苷酸。2、含有很多稀有碱基或修饰碱基。3、5′端总是磷酸化，且常是pG。4、3′端为CCAOH。5、二级结构为三叶草形。6、三级结构为倒L型。第三章．基因与基因组的结构基因（Gene）是DNA分子上的一段序列，一个基因包括一个蛋白质或RNA的全部编码序列和编码区之外对编码区转录功能所必要的非编码的调控区结构基因：编码蛋白质的基因;可被转录生成mRNA，进而翻译成蛋白质，表现出相应性状。工具基因：只转录成RNA，不再翻译成蛋白质；为蛋白质合成提供必要的工具。如rDNA、tDNA基因基因组是一种生物染色体内全部遗传物质的总和，包括构成基因和基因之间区域的所有DNA。基因家族（Genefamily）真核生物基因组中功能相似、结构具有同源性的一组基因。持家基因（housekeepinggene）在不同种类的细胞中均表达，功能对于每个细胞都必需；奢侈基因（luxurygene）仅在特定的细胞类型中表达；占基因总数10％跳跃基因（jumpinggene）从基因组上的一个位置转移到同一条染色体或另一条染色体的另一个位置，引起相应控制性状的改变。1.重叠基因：共同使用同一DNA序列，但编码两种不同蛋白质的基因。2.割裂基因（也称断裂基因）：外显子（exon）：编码的DNA序列，即被表达的DNA区段内含子（intron）：不编码的DNA序列3.不连续基因：在基因编码蛋白质的序列中插入与蛋白质编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段4.假基因：核苷酸序列与编码某一蛋白质的基因相似，但不具功能，不能转录形成成熟mRNA或不能翻译出功能蛋白质。假基因的特点：①重复的假基因（已有基因在结构上发生较大变化而失去功能后形成）②加工的假基因（没有启动子和内含子，在3端有一段延伸的短A-T碱基对序列，似poly(A)尾巴。）5.C值矛盾最大C值(单倍体基因组总DNA的含量)最小C值（编码基因信息的总DNA含量）不一定最小C值小于最大C值（如重叠基因）A生物体进化程度高低与大C值不成明显相关（非线性）B亲缘关系相近的生物大C值相差较大C一种生物内大C值与小c值相差极大（Euk.人体c=C/10）(Prok.Φx174c＞C)C值大小与生物进化程度并不完全呈相关关系，基因组中存在许多不编码蛋白质的DNA序列6真核生物基因组DNA的序列①单拷贝序列非重复序列，在基因组中仅有一个拷贝，大多数结构基因②轻度重复序列（2-10个拷贝，包括rRNA、tRNA和一些结构基因如组蛋白基因）②中度重复序列(十至数百个拷贝,分散于整个基因组中;一般为不编码序列,起基因调控作用)③高度重复序列（无选择压力，可保留在群体中；可分为3种：卫星DNA、小卫星DNA和微卫星序列）微卫星DNA:由2-6个bp单位组成的串联重复序列，分散于整个核基因组。如TGTG……TG=(TG)n又称简单重复序列（simplesequencerepeats,SSRs）、短串连重复（shorttandemrepeat,STR），以1-6的短核苷酸序列（核心序列）为基本单位，呈串连重复状散在分布于生物体整个基因组中7.原核生物和真核生物基因组的特点原核生物基因组：环状或线状的双链DNA分子所含有的全部基因，有的还包括染色体外的质粒基因组。原核生物的基因结构特点：基因组较小，编码区和非编码区组成，非编码DNA比例较少，无内含子；有操纵子结构，且为多顺反子；结构基因多为单拷贝，rRNA基因多拷贝；有些基因之间可以形成重叠基因；真核生物基因组（核基因组和核外基因组，其中核外基因组又分为线粒体基因组和叶绿体基因组）核基因组:真核生物单倍体染色体所含的一整套基因。基因组的特点:1)基因组较大，结构复杂，大部分位于细胞核中，为双链线状，并与蛋白质结合形成染色质，而且染色体数目往往不是一条，而是多条;2)每条染色体的DNA分子具有多个复制起点，基因内存在内含子。真核基因多为断裂基因;3)编码序列仅占基因组DNA的一小部分，绝大多数为非编码序列；4)基因组中存在大量的重复序列。重复序列在人基因组中约占50％；5)转录产物为单顺反子mRNA,即一mRNA只能翻译成一种蛋白质。线粒体DNA基因组特征1)分子结构简单：2)mt-DNA的相对分子量低3)进化速度快（mt-DNA聚合酶不具备校对修复能力；碱基不配对频率高,复制易发生错误。）4)无组织特异性5)核苷酸组成不均一（4种碱基组成偏离随机组成；G+C的摩尔分数在15-50％间变化）转座子，转座子两端为反向重复转座后,转座子两侧形成靶位点的正向重复外显子与内含子连接区特征：内含子两端序列之间没有广泛的同源性和互补性；连接区高度保守，几乎每个内含子5‘端起始两个碱基为GT，3’端最后两个碱基为AG，即5‘GT…….AG3’选择性剪接：同一区段DNA序列可以加工生成两条或两条以上的链注意线粒体基因组和核基因组特点的区别第四章．DNA的复制1.DNA复制的概念及特点复制：亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。（1）DNA的半保留复制：DNA复制时以亲代的每一条DNA链为模板，按照碱基互补配对的原则，合成与其互补的DNA链，在子代DNA中，一条链来于亲代DNA，另一条链是新合成的。DNA的这种复制方式称为半保留复制（2）DNA复制方式：a、新起始方式（denovoinitiation）或复制叉式（replicationfork）复制叉（Replicationfork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点。环状DNA：θ型复制b、滚环式复制（如病毒、细菌因子）由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制。c、D环复制（如线粒体叶绿体DNA的复制方式）特点：复制起点不在双链DNA同一位点（3）DNA的半不连续复制半不连续复制：前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制的半不连续性。A.模板链：以3’→5’方向的亲代DNA作模板链：子代链：子代链在复制时聚合方向为5’→3’的连续进行复制，这一条链被称为前导链(leadingstrand)。（复制方向与解链方向一致）B.模板链：以5’→3’方向的亲代DNA链为模板链子代链：子代链在复制时聚合方向也是5’→3’，但是不连续复制，这条链被称为滞后链(laggingstrand)。（复制方向与解链方向相反)C.DNA在复制时，由滞后链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。D.冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000bp，在真核生物中约为100-200bp。E.DNA连接酶即将相邻的两个岗崎片段连接起来，并催化两者之间的3’5’-磷酸二酯键形成。2.DNA复制的保真性①DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；②RNA引物；③遵守严格的碱基配对规律；④DNA聚合酶(3’-5’外切酶活性)本身具有校对作