杨树花叶病毒病检疫技术操作办法

杨树花叶病毒病检疫技术操作办法字体：大中小2009-9-1来源：省林检局阅读：170次[关闭]11主主题题内内容容及及应应检检范范围围11..11本本办办法法规规定定了了杨杨树树花花叶叶病病毒毒PPooppllaarrmmoossaaiiccvviirruuss((PPooppMMVV))的的检检疫疫检检验验及及检检疫疫处处理理操操作作办办法法。。11..22本本办办法法适适用用于于林林业业植植物物检检疫疫机机构构对对杨杨属属PPooppuulluusssspppp..植植物物活活体体的的检检疫疫检检验验和和检检疫疫处处理理。。22产产地地检检疫疫22..11种种苗苗繁繁育育基基地地的的建建立立22..11..11严严禁禁采采用用有有疫疫情情或或无无症症带带毒毒苗苗木木、、插插条条进进行行育育苗苗。。22..11..22外外来来品品种种，，或或从从疫疫情情发发生生区区调调入入的的无无性性繁繁殖殖材材料料，，必必须须经经检检验验合合格格，，或或在在隔隔离离区区试试种种证证明明无无病病后后，，方方可可种种植植培培育育。。22..22踏踏查查22..22..11在在种种苗苗繁繁育育基基地地、、杨杨树树栽栽植植地地、、四四旁旁树树，，以以自自然然界界线线、、道道路路为为单单位位进进行行线线路路（（目目测测））踏踏查查。。22..22..22调调查查寄寄主主叶叶片片是是否否呈呈现现花花叶叶、、星星状状褪褪绿绿斑斑点点、、叶叶脉脉坏坏死死、、叶叶柄柄基基部部肿肿大大、、茎茎上上现现小小枯枯斑斑或或裂裂口口。。22..22..33调调查查寄寄主主叶叶片片上上的的小小支支脉脉是是否否出出现现橘橘黄黄色色线线纹纹或或叶叶面面布布有有橘橘黄黄色色斑斑点点、、主主脉脉或或侧侧脉脉呈呈紫紫红红色色坏坏死死斑斑、、叶叶片片皱皱缩缩提提早早落落叶叶。。22..22..44确确认认有有疫疫情情需需进进一一步步掌掌握握危危害害情情况况的的，，应应设设标标准准地地（（或或样样方方））做做详详细细调调查查。。22..33标标准准地地（（或或样样方方））调调查查22..33..11种种苗苗繁繁育育基基地地样样方方设设置置与与调调查查22..33..11..11样样方方的的累累积积面面积积应应不不少少于于调调查查总总面面积积的的55%%。。22..33..11..22每每块块样样方方面面积积为为55mm22，，样样方方内内的的苗苗木木应应逐逐株株进进行行调调查查。。22..33..22林林分分标标准准地地设设置置与与调调查查22..33..22..11片片林林按按林林分分面面积积设设置置标标准准地地，，5500hhmm22以以下下（（含含5500hhmm22））至至少少设设33块块，，5500hhmm22以以上上每每增增加加3300hhmm22增增设设11块块。。四四旁旁树树每每220000株株设设11块块。。22..33..22..22每每块块标标准准地地面面积积为为00..11hhmm22，，在在标标准准地地内内随随机机抽抽取取样样树树2200––3300株株；；进进行行病病害害分分级级调调查查。。22..44病病害害分分级级标标准准ⅠⅠ级级植植株株健健康康代代表表值值00；；ⅡⅡ级级个个别别叶叶片片零零星星花花叶叶，，个个别别叶叶缘缘有有枯枯焦焦和和皱皱缩缩代代表表值值11；；ⅢⅢ级级植植株株叶叶片片一一半半有有花花叶叶，，叶叶缘缘有有明明显显枯枯焦焦和和皱皱缩缩代代表表值值22；；ⅣⅣ级级植植株株叶叶片片大大部部花花叶叶，，植植株株变变形形，，部部分分顶顶梢梢枯枯死死代代表表值值33；；ⅤⅤ级级植植株株全全部部花花叶叶、、矮矮小小，，全全株株枯枯梢梢代代表表值值44。。33调调运运检检疫疫33..11抽抽样样比比例例33..11..11苗苗木木及及繁繁殖殖材材料料按按一一批批货货物物总总件件数数（（株株））的的11%%抽抽取取，，少少于于2200株株（（条条））的的全全部部抽抽取取。。33..11..22国国外外引引进进的的品品种种、、品品系系及及疫疫情情严严重重的的，，需需增增大大抽抽样样比比例例或或逐逐株株调调查查。。33..22抽抽样样方方法法苗苗木木及及繁繁殖殖材材料料按按照照抽抽样样比比例例，，采采取取分分层层方方式式设设点点抽抽样样检检查查。。33..33现现场场检检验验33..33..11检检查查叶叶片片是是否否有有大大小小不不等等的的失失绿绿斑斑块块。。苗苗木木及及繁繁殖殖材材料料应应检检查查叶叶片片是是否否有有花花叶叶症症状状。。33..33..22现现场场确确认认有有花花叶叶症症状状的的，，需需将将样样品品带带回回室室内内作作进进一一步步鉴鉴定定。。44检检疫疫检检验验44..11症症状状检检验验66––99月月间间，，检检查查染染病病叶叶片片上上是是否否出出现现花花叶叶，，呈呈橘橘黄黄色色线线纹纹或或斑斑点点；；边边缘缘褪褪色色发发焦焦，，沿沿叶叶脉脉为为晕晕状状透透明明；；主主脉脉或或侧侧脉脉及及叶叶柄柄呈呈现现紫紫红红色色坏坏死死斑斑，，叶叶柄柄基基部部隆隆起起，，有有褐褐色色坏坏死死斑斑。。在在检检疫疫时时应应特特别别注注意意区区分分花花叶叶毒毒病病与与普普通通花花叶叶病病之之间间的的症症状状差差异异。。二二者者区区别别如如下下：：杨杨树树花花叶叶病病毒毒病病：：叶叶部部症症状状呈呈橘橘黄黄色色线线纹纹或或斑斑点点；；在在麦麦格格隆隆息息丰丰烟烟NNiiccoottiiaannaammeeggaalloossiipphhoonn上上叶叶部部的的症症状状呈呈叶叶脉脉坏坏死死、、系系统统花花叶叶状状；；发发病病盛盛期期在在88月月底底以以后后。。普普通通花花叶叶病病：：叶叶部部症症状状呈呈浓浓淡淡相相间间的的花花叶叶或或斑斑驳驳；；在在麦麦格格隆隆息息丰丰烟烟上上叶叶部部不不表表现现症症状状；；发发病病盛盛期期在在55月月下下旬旬至至66月月期期间间。。44..22鉴鉴别别寄寄主主试试验验44..22..11检检验验应应在在防防虫虫网网中中进进行行，，栽栽培培鉴鉴别别寄寄主主麦麦格格隆隆息息丰丰烟烟或或心心叶叶烟烟NN..gglluuttiinnoosseeaa的的花花盆盆和和土土壤壤需需高高温温消消毒毒。。44..22..22以以11%%尼尼古古丁丁水水溶溶液液作作缓缓冲冲液液，，按按11::44（（WW//VV））在在研研钵钵中中研研成成糊糊状状，，再再用用纱纱布布过过滤滤，，挤挤出出汁汁液液，，在在鉴鉴别别寄寄主主上上进进行行磨磨擦擦接接种种。。44..22..33在在烟烟草草叶叶面面上上洒洒少少量量金金钢钢砂砂（（550000目目））作作磨磨料料，，后后用用00..000055MM磷磷酸酸缓缓冲冲液液冲冲洗洗多多余余汁汁液液或或磨磨料料。。44..22..4433周周后后观观察察心心叶叶烟烟叶叶是是否否表表现现为为明明脉脉，，在在麦麦格格隆隆息息丰丰烟烟上上是是否否为为叶叶脉脉坏坏死死呈呈系系统统性性花花叶叶症症状状。。44..33电电镜镜检检验验44..33..11将将病病叶叶以以33::44（（WW//VV））加加入入00..55mmooll//LL磷磷酸酸钾钾缓缓冲冲液液（（ppHH77..00）），，含含00..0022mmooll//LL亚亚硫硫酸酸钠钠，，00..000055mmooll//LL的的乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸（（EEDDTTAA））和和00..0011mmooll//LL的的二二乙乙胺胺基基二二硫硫代代甲甲酸酸钠钠（（DDIIEECCAA））在在研研钵钵内内匀匀浆浆，，纱纱布布过过滤滤。。44..33..22滤滤液液中中加加入入等等体体积积的的氯氯仿仿搅搅拌拌1155mmiinn，，经经66000000rr//mmiinn离离心心1155mmiinn，，上上清清液液经经3300000000rr//mmiinn离离心心22hh，，沉沉淀淀物物以以缓缓冲冲液液去去掉掉DDIIEECCAA重重悬悬浮浮后后过过夜夜，，次次日日轻轻轻轻悬悬浮浮后后再再经经66000000rr//mmiinn离离心心1155mmiinn。。44..33..33上上清清液液以以重重悬悬浮浮液液配配成成6600%%––1100%%的的线线形形蔗蔗糖糖梯梯度度，，上上层层放放上上清清液液。。密密度度梯梯度度经经2255000000rr//mmiinn离离心心22hh。。离离心心后后取取病病毒毒带带，，用用22倍倍体体积积重重悬悬浮浮缓缓冲冲液液稀稀释释，，经经4400000000rr//mmiinn离离心心9900mmiinn。。44..33..44采采用用00..55mmooll//LL磷磷酸酸钠钠缓缓冲冲液液（（含含00..0022mmooll//LL亚亚硫硫酸酸钠钠和和00..000055mmooll//LLEEDDTTAA的的重重悬悬浮浮缓缓冲冲液液）），，ppHH77..00，，将将上上述述离离心心的的沉沉淀淀小小球球立立刻刻重重悬悬浮浮。。44..33..55将将病病毒毒样样品品置置于于附附有有FFoorrmmvvaarr膜膜的的铜铜网网上上，，用用22%%磷磷钨钨酸酸负负染染22mmiinn，，吸吸去去多多余余染染料料，，晾晾干干，，在在电电镜镜下下观观察察病病毒毒颗颗粒粒。。44..44血血清清学学检检验验血血清清学学技技术术根根据据实实验验条条件件可可分分别别选选用用免免疫疫双双扩扩散散、、酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验（（EELL11SSAA））和和免免疫疫电电镜镜等等。。EELL11SSAA方方法法如如下下：：44..44..11用用上上述述的的密密度度梯梯度度离离心心方方法法制制备备病病毒毒粒粒子子，，如如果果纯纯度度不不够够，，再再过过SSeepphhaarroossee44BB柱柱层层析析纯纯化化、、浓浓缩缩。。44..44..22抗抗血血清清制制备备和和免免抗抗PPMMVV抗抗体体的的提提纯纯：：用用提提纯纯的的PPMMVV免免疫疫家家兔兔。。免免疫疫时时加加等等量量福福氏氏完完全全佐佐剂剂，，乳乳化化后后做做皮皮下下及及皮皮下下肌肌肉肉多多点点注注射射。。共共注注射射44次次，，每每次次间间隔隔77dd，，末末次次静静脉脉加加强强免免疫疫后后77dd采采血血。。抗抗血血清清先先用用5500%%饱饱和和度度的的硫硫酸酸铵铵提提取取IIggGG抗抗体体。。将将其其溶溶于于一一定定体体积积的的无无菌菌生生理理盐盐水水中中，，再再用用3333%%饱饱和和度度的的硫硫酸酸铵铵反反复复提提取取33次次。。再再溶溶于于一一定定体体积积的的生生理理盐盐水水中中，，44摄摄氏氏度度冰冰箱箱对对生生理理盐盐水水透透析析，，直直到到用用奈奈氏氏试试剂剂检检查查无无NNHH44++为为止止，，再再于于44℃℃冰冰箱箱对对00..00117755mmooll//LL（（ppHH66..33））磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液透透析析过过夜夜。。抗抗体体溶溶液液离离心心去去沉沉淀淀后后过过DDEEAAEE——纤纤维维素素柱柱（（DDEE——3322））。。平平衡衡洗洗脱脱缓缓冲冲液液仍仍用用ppHH66..33，，00..00117755mmooll//LL磷磷酸酸盐盐，，分分管管收收集集洗洗脱脱液液，，用用分分光光光光度度计计测测各各管管228800nnmm和和226600nnmm吸吸收收值值，，收收集集吸吸收收峰峰的的洗洗脱脱液液，，44℃℃下下用用00..11mmooll//LL（（ppHH99..55））碳碳酸酸缓缓冲冲液液透透析析过过夜夜后后测测定定蛋蛋白白质质浓浓度度，，制制备备成成55mmgg//mmll，，供供标标记记用用。。44..44..33戊戊二二酫酫二二步步法法酶酶标标记记抗抗体体：：1100mmgg辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶溶溶于于00..22mmll含含11..2255%%戊戊二二酫酫的的00..11mmooll//LL，，ppHH66..88磷磷酸酸缓缓冲冲液液。。室室温温下下放放置置1