染色质免疫共沉淀技术的发展

染色质免疫共沉淀技术的发展姚汪劲松发育生物学2013级2013110046摘要：本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点，并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术，并对两种方法进行了比较。关键词：染色质免疫共沉淀；反向染色质免疫共沉淀；应用，研究前景。目前，不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验（EMSA），报告基因分析，DNA微阵列，质谱分析法MS，酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是被广泛应用于研究DNA和蛋白质相互作用的方法。真核生物基因组DNA以染色质形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中，转录调控是顺式作用元件(Cis-actingelements)如启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)与反式作用因子(Trans-actingfactors)相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰，核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性，哺乳动物转录调控序列分散在较大区域，组蛋白修饰状态达100多种，这些因素都增加了转录调控的复杂性。ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，随着生物技术的迅速发展，ChIP技术不断发展和完善，被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究，并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是，此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段；然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA与蛋白质之间的Schiff键水解，释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测，获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗(Scihff)键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂DMA(Dimethyladipimidate)或DSG(Disuccnimidylglutarate)处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面，在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位，这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此，用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体，并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如，Weitsman等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力，发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合，但不适合ChIP条件下使用，并且不同抗体的结合效率也有差异。对于某一目标蛋白采用多种抗体组合来进行ChIP实验是一种有效的方案。例如，Chen等针对CTCF在人类基因组中的结合位点研究，采用了多种不同单克隆抗体的混合物进行免疫沉淀。另外，有人利用表位附加标记技术表达融合蛋白进行免疫沉淀实验。常用的表位附加标记有红血球凝集素(Hemagglutinin)、生物素和c-Myc等。但哺乳动物细胞中难以引入表位附加标记的融合蛋白，并且其表达往往不同于其内源转录因子。染色质免疫沉淀获得的DNA数量往往很多，其中包含大量的非特异结合造成的背景噪音，采用严格的洗涤条件可以降低背景。Ogryzko等将靶蛋白与生物素受体片段融合表达，通过抗生物素磁珠免疫沉淀，二者较强的结合力便于进行更为严谨的洗涤，达到降低背景的目的。与传统的研究转录因子和DNA相互作用的方法相比，染色质免疫共沉淀技术是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的理想方法。ChIP的优点在于能够在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用，能同时快速地提供一种或者多种基因的调控机制，因此有巨大的应用价值。ChIP技术也有一定的局限性：第一，该技术需要抗目的蛋白或者特殊修饰标签的高度特异性抗体。第二，假阴性信号可能源于无效的抗体结合或者在交联过程中抗原受到干扰。第三，甲醛固定可能是暂时的，甚至是非特异的，可能导致相邻的蛋白形成假阳性信号。针对以上三方面，推荐在交联之后和抗体沉淀之前绘制一条标准曲线，以确定每次实验所需染色质的最佳量，确保材料的起始量相等。当检测的染色质模版（目的抗体的染色质免疫沉淀物）扩增出可检测的条带时，将染色质样品连续稀释以确定关键点；而此时对照（mockChIPed）染色质模版需要浓缩以扩增出可见的条带。总之，染色质免疫共沉淀的步骤是需要精确的且要求一系列的预实验。第四，难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。反向染色质免疫共沉淀技术（reversechromatinimmunoprecipitationassay，ReverseChIP）可以弥补这个缺陷，并且能定性、定量地准确鉴定目的蛋白质。ReverseChIP是一种在体内状态下分析DNA和蛋白质相互作用的新方法。它用特异的核酸探针捕获靶DNA片段及与其相结合的蛋白质。蛋白质用质谱仪检测，以确定靶DNA位点全部相关的蛋白质。这种技术可对靶DNA位点相关蛋白质进行全面、系统地鉴定，特别能找到已知DNA元件相应的调节蛋白。其在发现鉴定、靶DNA位点相关蛋白质和研究DNA和蛋白质相互作用方面有重要的应用价值。研究DNA-蛋白质相互作用的技术方法有多种，但研究体内状态下的方法仅有染色质免疫共沉淀技术(ChIP)。而该方法尚存在不足，如：难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。ReverseChIP技术正好能弥补这些缺陷，并且可定性定量地准确鉴定目标蛋白质。由于DNA探针杂交技术和质谱方法的进步，Kingston和Déjardin于2009年1月建立了PICh(proteomicsofisolatedchromatinsegments)技术，来验证端粒相关蛋白质。Mittler，Butter和Mann于2009年1月建立了SILAC(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture)技术，来分析靶DNA位点相关蛋白质。2009年3月，Rusk把这两种方法综合到一起，做了简要介绍，并将其命名为reverseChIP技术。ReverseChIP技术的核心是用DNA探针捕获靶DNA片段及与其相关的蛋白质。其基本原理是在活细胞状态下用甲醛固定细胞，以交联DNA-蛋白质的复合物。然后将此复合物超声切断为一定长度的染色质片段，用以脱硫生物素为标记物的DNA探针与靶DNA片段杂交，形成稳定的DNA探针-靶DNA片段及其相关蛋白质的杂交体。之后用亲和素磁珠结合脱硫生物素，以捕获此杂交体，离心得到的磁珠与杂交体被洗脱液洗脱，杂交体被游离出来。加入交联反转液，使DNA-蛋白质复合物解交联，电泳得到靶DNA位点相关蛋白质，经纯化后，再进入质谱仪进行检测，以达到确定靶DNA位点全部相关蛋白质的目的，进而获得DNA-蛋白质相互作用的定性定量信息。与目前其它研究DNA-蛋白质相互作用的技术方法相比，ReverseChIP技术具有以下优点：(1)可以同时得到靶DNA位点上多个蛋白质结合的信息；(2)此技术不使用抗体，只需要合成特定序列的DNA探针，以用来分析任何靶DNA位点上的相关蛋白质；(3)ReverseChIP技术具有很高的灵敏度，可以用来分析低丰度的相关蛋白质；(4)能定性定量地鉴定相关蛋白质。由于该项技术发明时间尚短，亦存在一定的不足。如依赖核酸杂交以检测与靶DNA相结合的蛋白质，可能因探针与某些非靶DNA杂交而产生干扰.又如该技术需要纯化足够量的蛋白质，以满足质谱检测的需要，这可能要求大量的起始材料，也就是说需要处理大量的细胞。随着功能基因组学研究的深入开展，在染色质水平研究基因的表达调控，是全面阐明真核基因表达调控机制的必经之路。染色质免疫共沉淀技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。该技术被广泛应用于组蛋白转录后调控，组蛋白变体，转录因子，位于基因组或已知基因座上的染色质调控酶的定位等方面的研究。ChIP技术的应用使核蛋白和DNA的相互作用在基因表达、细胞分化或者抗病性等方面的研究有了很大的突破。特别是，ChIP技术能够揭示转录因子的结合位点和确定直接的靶基因序列，可在体内分析特定启动子的分子调控机制，因此被广泛应用于转录调控机制的研究方面。另外，以ChIP技术为基础的多种技术的应用，能够确定转录因子的结合基元，为转录因子生物学的研究提供了重要方法。染色质免疫共沉淀技术与其它方法的结合，扩大了其应用范围。近年来，ChIP技术与DNA微阵列芯片技术或高通量测序技术结合已经广泛应用于特定反式因子靶基因的高通量筛选方面，能够作出组蛋白修饰，组蛋白变体，整个基因组范围内转录因子的图谱。RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP技术的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。参考文献[1]FriedMG.Measurementofprotein-DNAinteractionparametersbyelectrophoresismobilityshiftassay[J].Electrophoresis,1989,10(5/6):366-376.[2]HellmanLMFriedMG.ElectrophoreticmobilityshiftassayEMSAfordetectingprotein-nucleicacidinteractions[J].NatureProtocols,2007,2(8):1849-1861.[3]WoodKV.Markerproteinsforgeneexpression[J].CurrentOpinioninBiotechnology,1995,6(1):50-58.[4]ChalfieMTuYEuskirchenGetal.Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression[J].Science,1994,263(5148):802-805.[5]BulykML.DNAmicroarraytechnologiesformeasuringprotein-DNAinteractions[J].CurrentOpinioninBiotechnology,2006,17(4):422-430.[6]BonaldiTRegulaJTImhofA.Theuseofmassspectrometryfortheanalysisofhistonemodifications[J].MethodsinEnzymology,2004,377:111-130.[7]BurlingameALZhangXChalkl