湖南臭豆腐发酵过程中优势微生物的分离及应用研究

湖南臭豆腐发酵过程中优势微生物的分离及应用研究指导老师：蒋立文教授小组成员：王兰、陈思思、王雪艳主要内容•立项依据•实验创新点•预期成果•实验进度一、立项依据•臭豆腐是我国著名的传统发酵豆制品，具有很高的营养价值，长沙的臭豆腐则选用上等黄豆做成豆腐，然后把豆腐浸入放有冬笋、香菇、曲酒、浏阳豆豉的卤水中发酵一段时间，初闻臭气扑鼻，用油锅慢慢炸，直到颜色变黑，表面膨胀以后，就可以捞上来，浓香诱人，浇上蒜汁、辣椒、香油，即成芳香松脆、外焦里嫩的臭豆腐。根据国内有关文献，南方臭豆腐风味形成除特制卤水外，微生物在臭豆腐特殊风味和高营养价值的形成过程中起着至关重要的作用。但是臭豆腐没有形成产业化规模，质量很不稳定，安全隐患多，甚至还有添加非法添加剂，不利于这种地方特色产品的推广。国内研究表明，从臭豆腐卤液中可以分离出6株可培养细菌,采用传统的微生物鉴定方法和16SrDNA鉴定方法对其进行了鉴定,其中5株为芽孢杆菌属,1株为鲁氏不动杆菌。通过提取卤液中细菌总DNA、16SrDNA扩增、构建克隆子、限制性内切酶片段长度多态性分析等对卤水中总细菌的多样性进行了研究,得到14种不同的基因分型,并对每种分型的代表克隆子进行测序,BLAST比对显示有部分细菌与Genbank中的细菌同源性较低,共得到3种有益乳杆菌,2种致病乳杆菌,2种螺旋体菌,2种拟杆菌,1种放线菌。三种方法结合,展示了臭豆腐卤液中主要含有两类有益菌：芽孢杆菌属和乳杆菌属,同时含有多种致病菌。另外也有研究，从臭豆腐的发酵浸泡液中分离菌种，获得了2个主要菌株，依形态不同分为球菌和杆菌两大类，分离、纯化、鉴定后，初步确定为奈瑟氏菌属(球菌）和环状芽孢杆菌属（杆菌）。国外暂无此类研究。通过研究豆腐坯在卤液发酵的过程中各类微生物的变化情况，了解卤液在不同发酵阶段各类微生物的消长规律，寻找出卤液风味、营养物质变化相关的关键微生物，为实现臭豆腐的纯种发酵过程并使之标准化、可控制化、安全化生产提供理论依据。二、试验创新点1、对卤液发酵过程中各种微生物的消长规律进行的研究并得到优势微生物。2、利用优势微生物进行纯培养发酵的模拟，为标准化、安全化生长提供依据。三、预期成果•1、得出卤液及豆腐坯在发酵过程中各类微生物的变化情况，了解卤液在不同发酵阶段的优势微生物；•2、得到2-3株具有优良发酵性能的臭豆腐发酵专用微生物；•3、获得卤液及臭豆腐接种发酵的最佳条件。四、试验进展1、卤水中菌落总数测定一、检验程序25mL卤水+225mL无菌生理盐水，振摇使其充分混合均匀→10倍系列稀释→选择2-3个适宜样品匀液，各取1mL分别加入无菌平皿内→每个平皿内加15-20mL平板计数琼脂培养基→待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h→观察结果并记录→报告1、卤水中菌落总数测定二、实验结果一、检验程序25mL卤水+225mL无菌生理盐水，振摇使其充分混合均匀→10倍系列稀释→选择2-3个适宜样品匀液，各取0.1mL→涂布在无菌的孟加拉红平板上→28±1℃，培养5天→观察结果并记录→报告2霉菌、酵母菌数测定二、实验结果一、菌种的分离用无菌吸管吸取0.1mL卤水样液滴在无菌的MRS固体平板上，用玻璃刮铲涂匀，置于35℃恒温培养箱中培养2天，长出菌落后，用接种环挑取少量菌再在无菌的MRS固体平板上划线，直至出现单菌落，挑取单菌落在无菌的MRS固体平板上划线，获得纯培养。3乳酸菌的分离鉴定二、革兰氏染色及镜检在干净的载玻片中央加一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作方法取出培养了18-24h的上述乳酸菌纯培养体，涂成均匀的薄层，干燥→结晶紫液染色1min，水洗多余的染料结晶→碘液媒染固定1min，水洗→95%的酒精脱色10-15S，立即用水冲洗→蕃红复染2min，水洗，干燥→镜检三、薄层层析法鉴定乳酸菌展开剂水：正丁醇：苯甲醇=1：5：5的量混合,然后加入1%的甲酸。显色剂0.04%的溴酚蓝乙醇溶液,用0.1mol/LNaOH调节pH6.7。在层析板纸张下方距边约2cm处划条横线,每隔2.5~3cm划一点作为点样位置,并注明点样编号。在点样的同时用2%和的标准乳酸两个样品作为对照，将层析板放入展开槽中,先用展开剂开始展开.一般上行25cm即可,取出晾干，喷显色剂,观察样品上行是否出现有黄色斑点,并与对照比较黄点位置，以确定是否是乳酸菌。试验中存在的问题•1、卤液制作过程中微生态变化费用•培养液下一步•细化