核磁共振新技术.

核磁共振新技术及其应用•核磁共振概述•核磁共振新技术及应用概述•核磁共振的方法与技术作为分析物质的手段，由于其可深入物质内部而不破坏样品，并具有迅速、准确、分辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用，已经从物理学渗透到化学、生物、地质、医疗以及材料等学科，在科研和生产中发挥了巨大作用。•核磁共振是1946年由美国斯坦福大学布洛赫(F.Bloch)和哈佛大学珀赛尔(E.M.Purcell)各自独立发现的，两人因此获得1952年诺贝尔物理学奖。50多年来，核磁共振已形成为一门有完整理论的新学科。12位因对核磁共振的杰出贡献而获得诺贝尔奖科学家•1944年I.Rabi•1952年F.Block•1952年E.M.Purcell•1955年W.E.Lamb•1955年P.Kusch•1964年C.H.Townes•1966年A.Kastler•1977年J.H.VanVleck•1981年N.Bloembergen•1983年H.Taube•1989年N.F.Ramsey•1991年R.R.Ernst核磁共振原理半数以上的原子核具有自旋，旋转时产生一小磁场。当加一外磁场，这些原子核的能级将分裂，既塞曼效应。在外磁场B0中塞曼分裂图：共振条件：=0=0实现核磁共振的两种方法a．扫场法:改变0b．扫频法:改变核磁共振新技术•核磁双共振•二维核磁共振•NMR成像技术•极化转移技术•魔角旋转技术•高效液相色谱与核磁共振联用技术（LC-NMR）核磁双共振双核自旋系统检测器2扰动1脉冲•双共振是同时用两种频率的射频场作用在两种核组成的系统上，第一射频场B1使某种核共振，第二射频场B2使另外一种核共振，这样两个原子核同时发生共振。•第二射频场为干扰场，通常用一个强射频场干扰图谱中某条谱线，另一个射频场观察其他谱线的强度、形状和精细结构的变化，从而确定各条谱线之间的关系，区分相互重叠的谱线。二维核磁共振及多维核磁共振二维核磁共振使NMR技术产生了一次革命性的变化，它将挤在一维谱中的谱线在二维空间展开（二维谱）,从而较清晰地提供了更多的信息。二维核磁共振的脉冲序列预备期发展期混合期探测期S(t1,t2)S(t1,2)S(1,2)F(t2)F(t1)t2t112二维谱示意图2D在研究更大分子体系时，谱线也出现了严重的重叠，为了解决这一问题，人们将2D推广到3D甚至多维。NMR成像技术•投影重建成像方法•Fourier成像方法•弛豫时间成像方法•逐点扫描方法•线扫描方法•切片扫描方法•高分率成像和快速成像法极化转移技术灵敏核非灵敏核检测（非灵敏核）J脉冲序列1脉冲序列2极化转移(PT)是一种非常实技术，它用二种特殊的脉冲序列分别作用于非灵敏核和灵敏核两种不同的自旋体系上。通过两体系间极化强度的转移，从而提高非灵敏核的观测灵敏度，基本的技巧是从高灵敏度的富核处“借”到了极化强度。在NMR测定中，为取得高质量的谱图，要求磁场均匀，样品的填充因子高，磁化率均匀，前两个因素可以通过硬件研制不断改善，而磁化率均匀与否则与样品性质、数量及周围环境直接相关，这样，当样品量有限时,就必须考虑磁化率的均匀性。1982年，魔角旋转（MAS）开始用于高分辨工作，此后，将MAS用于小体积微量样品引起了兴趣，实验表明运用MAS可以消除固体及非均相溶液中磁化率不同而造成的谱线加宽。样品应以相当或大于1.8kHz转速下旋转，可使边带得到有效抑制，根据这些结果，成功地设计了新型的超微量探头。超微量探头的发展概况魔角旋转技术在固体中自旋之间的耦合较强，共振谱较宽，掩盖了其他精细的谱线结构，耦合能大小与核的相对位置在磁场中的取向有关，其因子是(3cos2β-1)，如果有一种方法使β=θ=54.440（魔角），则3cosβ-1=0，相互作用减小，达到了窄化谱线的目的。魔角旋转技术就是通过样品的旋转来达到减小相互作用的，当样品高速旋转时β与θ的差别就会平均掉。•90年代中，一种与常规高分辨液相探头设计完全不同的超微量探头（目前称之为NanoNMRProbe，下同）问世了，这种探头与常规固体高分辨探头也不尽相同，后者为高功率，高速魔角旋转用于消除化学位移各向异性和使偶极偶合平均化，对于磁化率的不连续性是不考虑的。另外，常规MAS探头对线宽要求仅为5Hz（甚至50Hz），而1H微量探头因为1H核本身总的谱宽窄，要求线宽＜0.5Hz（CDCl3在丙酮-d6）中，特殊设计的NanoNMRprobe，其成功之处在于将体积很小的样品（＜40μL），能100%地保持在检测线圈内，并确保填充因子高，和均匀的磁化率，以得到最高灵敏度，构成探头的物料也必须使磁化率的不连续性达到最小，才能达到最小的线宽。NanoNMRProbe超微量探头的结构原理•NanoNMRProbe内腔长28mm，魔角（54.7°），转速在1.5~2.0kHz之间，为保持长期稳定性，带有2H锁线圈，并有变温功能，探头种类有直接检测用的1H和13C{1H}和间接检测用的1H{13C}探头，样品体积最大为40μL，可取得线形好，灵敏度高和分辨率最佳的谱图，若样品量很少，溶剂量可相应减少，保持样品有一定浓度，溶剂杂质及伪峰不会增加，还可提高动态范围，只要氘代试剂的量能保证场一频联锁，即使样品溶液体积未充满整个样品管（40μl），也不会使匀场变坏，或使谱线变宽，确保取得高质量的谱图。NanoNMRProbe的应用•1、超微量样品的测定样品量不同的薄荷醇,分别为为40μg，4μg和400ng，溶于CD2C12中,采样次数分别为4次,400次和32240次.2、Nano探头在组合化学中的应用•组合化学是近二十年发展起来的一种快速合成与筛选大量化合物的新方法，其在发现和优化药物先导化合物的过程中发挥了重要作用。组合化学包括了组合合成、群集筛选和对感兴趣化合物结构解析的三大步骤。因而有“平行”合成技术、“混-分”合成技术、编码-解码技术、“一珠一化合物”技术、“位置扫描”技术、天然寡聚物的生物组合合成及筛选技术、“动态化学库”技术、“多样性”导向的组合合成技术、“Microarray”技术、组合配基装配、“非天然”天然组合化学库合成技术等等。•在多种合成方法中，“一珠一化合物”技术最大的优点是化学库的空间可分离性，亦即化学库中所有的化合物同时并存且相互独立，因而，这种树脂珠-化学库的方式可直接用于固相筛选法。利用该技术在短时间内迅速合成并筛选的化合物可以达到几千万这样的天文数字，大大加快了发现药物先导化合物的步伐。但是在产物分析中，由于树脂引起磁场的不均匀，常规的NMR技术受到了限制。较早的做法是将反应的中间体或最终产物从树脂上切落下来，再利用常规方法进行分析和鉴定。这种方法费时，费样，而且经常破坏化合物的结构，得出错误的信息。九十年代初发展的高分辨魔角核磁共振技术(Highresolutionmagicanglespinning(HR/MAS)NMR)可以克服树脂引起的磁场不均匀性,得到最高灵敏度和最小线宽的NMR谱图。该技术不破坏样品，可灵敏、直接地提供偶联在树脂上化合物的结构信息。顶部谱图用常规5mm液体高分辨探头91．1mg干树脂，扫描一次中部谱图：用常规5rnm固体CP／MAS探头，树脂样品为20.2mg．转速为3.8kHz，扫描8次底部谱图：用Nano探头，树脂用量仅为5.4mg，魔角转速为2kHz，扫描8次•目前，广泛用于监测固相合成反应；指导反应条件的优化;鉴定固载在单一树脂珠上化合物的结构；以及分析树脂上固载化合物的构象等等。高分辨魔角核磁共振是组合化学中有用的分析工具，可以跟踪固相有机合成反应，快速直接地提供连在树脂上的化合物的结构信息，指导反应条件的优化，它能直接简便地定量反应的产率，而这种分析方法恰恰在常规NMR中很难实现。高效液相色谱与核磁共振联用技术（LC-NMR）•1、LC-NMR技术发展概况①NMR谱仪的灵敏度较低；②系统无法应付较大的动力学范围；③流动检测池和探头没有商品化以及溶剂峰压制效果不理想。2、LC-NMR联用技术的软硬件及原理•1）计算机软件支持•2）LC-NMR联用的相关硬件a.NMR流动探头b.HPLC系统c.峰敏技术d.在线/离线组份收集器3、技术问题及解决措施•动力学范围不够宽•色谱分辨率的丧失•HPLC-NMR通信•NMR灵敏度解决方法：1）流速、检测池及探头2）溶剂峰压制不同的溶剂峰压制技术大都是基于化学位移和驰豫时间的不同而设计的，理想的峰压制技术应满足以下几点要求：•（1）消除溶剂峰而不干扰所要的信号•（2）不影响峰压制区域以外的信号强度•（3）能同时压制多个溶剂峰•（4）易于实现以避免损失测试信号•（5）在梯度HPLC体系中能跟随溶剂信号位置改变而改变WET序列，已经可以成功地完成HPLC-NMR中使用普通试剂而必需的峰压制4、LC-NMR的操作模式及其应用•1）操作模式a连续流动：在洗脱过程中，溶剂组成不断变化，给峰压制造成一定困难，另外样品停留时间短，灵敏度低，一般只适用于1H和19F测试。b停止流动：顾名思义即使溶液停留于检测池中进行测试。当组分的保留时间已知，或者HPLC-NMR采用灵敏的在线检测器时，可以采用这种方法。c分时止流：按一定的时间间隔暂停流动相，来检测NMR谱。这种方法在被检组分没有UV发色团时尤其适用。通过HPLC-NMR谱，也可以估计色谱峰的纯度。d收集分析：色谱洗脱峰被预先收集到一个样品池中，然后进行离线NMR检测。e紫外激发：这种方法主要是利用软件技术，在UV检测到组分峰时，经过计算将样品组分准确地滞留于检测池中，并通过NMR进行采样。•2）应用范围a在药物代谢研究中应用b食品化学c高聚物分析d在天然产物化学中的作用e环境化学中的应用藤黄酸大鼠胆汁代谢产物结构确证研究•藤黄酸是从中药藤黄中分离得到的化合物，其抗癌作用与一般的化疗抗癌药物有所区别，实验研究结果表明，藤黄酸对多种肿瘤显示较强的抗肿瘤活性，并在有效计量范围内毒副作用比较小，对肿瘤细胞的抑制有非常高的选择性，能选择性的杀死癌细胞，而对正常动物造血系统和免疫功能没有影响，这是目前肿瘤化疗药物所不具备的。药代动力学研究已显示，藤黄酸在肿瘤组织中有较高的分布和较长的持续时间。藤黄酸HPLC分析的色谱条件色谱柱为InertsilODS柱，5μm(150×4.6mm)；柱温30℃；流动相为乙腈-水-醋酸(85：15：1)，流速1.0ml/min，280nm检测。A空白胆汁色谱图BII代谢物分析色谱图CI相代谢物分析色谱图D藤黄酸色谱图藤黄酸在大鼠胆汁中可检测到2个主要代谢产物，即代谢物1（MT1，Rt=17.996min）和代谢物2（MT2,Rt=19.557min）。LC-NMR的分析条件•采用Varian公司的Prostar-230高效液相色谱仪，分析柱为InertsilODS-3柱(150×4.6mm)。流动相为D2O:CH3OH=85:15。流速为1ml/min，检测器为VarianProstar-330二极管阵列检测器，紫外检测波长为280nm。•将服药胆汁样品溶于200μl甲醇和水的混合溶剂中。在INOVA-500LC-NMR上，用停止流动的方法分别采集LC-1HNMR谱。进样量为25μl，采用WET方式压制溶剂峰。谱宽7500Hz，1H谱采样时间为1.5s，驰豫时间为1s，采样数据点16K，累加次数为256。MS图谱MT1的ESI-MS给出[M-1]-为m/z645，故其分子量为646，与藤黄酸（628）相比，质量数多18，可能为藤黄酸的羟基化物。代谢产物2的LC-MS谱给出MT2的[M-H]-峰为m/z643，故其分子量为644。比藤黄酸质量数(628)多16。MT1(上图)，MT2(中图)和藤黄酸(下图)LC-1HNMR低场区信号比较代谢物1(MT1)的结构分析•（1）高场区：•MT1的1H-NMR谱高场区示有多个甲基信号(δ1.73(6H,s),1.66,1.65,1.63,1.56,1.36,1.35(each3H,s))，与藤黄酸类化合物的1HNMR谱特