溶胶凝胶技术在电化学传感器中的应用进展

溶胶凝胶技术在电化学传感器中的应用进展摘要本文主要评述了近年来溶胶凝胶技术在电化学传感器中的研究进展，包括在测定酚、葡萄糖类等物质实验方面的介绍，并探究了溶胶一凝胶与血红蛋白有较好的生物兼容性。结合了碳纳米管方面的应用制备了一种性能优良的葡萄糖生物传感器。关键词溶胶-凝胶；电化学传感器；葡萄糖；碳纳米管；1引言溶胶一凝胶技术是指有机或无机化合物经过溶液、溶胶、凝胶而固化，再经过热处理而制得氧化物或其他化合物固体的方法。近年来，人们发现溶胶一凝胶材料是一类非常适合于固定生物试剂的基质材料[1-5]．凝胶过程通常在温和的条件下进行，可以很大程度地保持酶等生物物质的功能和活性L[6-7]．利用溶胶一凝胶技术固定各种生物试剂基质材料，制成的生物传感器具有灵敏度高、稳定性好、抗干扰能力强等特点[8-11]．溶胶凝胶包埋酶的过程中，胶体粒子逐渐聚集形成三维网络结构。一些添加剂聚乙二醇(PEG)，聚乙烯胺(PEI)等覆盖硅胶中，能提高酶的活性。同时也能减少溶胶凝胶的收缩，作为孔径填充物防止孔塌陷。研究中发现将多羟基高分子掺人溶胶中，由于形成互穿网络而显著增大了凝胶的强度，从而防止了干裂。陈化时间对凝胶孑L径大小、交联程度有较大的影响。同时，在不同的介质中陈化时，也会得到不同的凝胶干缩结构，如在酸性介质中，得到的凝胶结构致密，孔径较小，故有利于酶分子的包埋。利用溶胶一凝胶技术固定生物酶制备的生物传感器在测酚、有机溶剂和糖类等物质中有着很好的效果。2溶胶-凝胶技术固定生物酶制备的生物传感器测定酚、糖类等物质2.1测定含饱和苯系物废水中的酚类化合物采用正硅酸乙酯水解制备溶胶一凝胶包埋酶制作溶胶一凝胶电极，以提高电极的灵敏度，增强电极的选择性和抗干扰能力。测定了含饱和苯系物废水中的酚类化合物，。溶胶一凝胶的制备先将TEOS溶于无水乙醇，加入一定量水，用HC1调节溶液pH值，然后放人梨形瓶中，恒温下用旋转蒸发仪定速搅拌水解一定时间后，再加入丙三醇继续搅拌，二次水解30min。电极的制作将石蜡碳糊填于预处理好的电极杆底部压实，在碳糊电极表面留有一层约1妈妈深的凹槽，待用。称取0．1mg酪氨酸酶(50000U／17mg)溶解于缓冲溶液(pH：7．0)中，加入陈化好的溶胶一凝胶搅拌均匀，再用碳粉调成糊状填人上述预留凹槽中并压实，在硫酸纸(放在光滑玻璃板上)上磨光，用渗析膜包好，置于冰箱冷藏室里陈化一天待用。电极使用前先在pH5．4的磷酸盐缓冲溶液中浸润。电极不用时于冰箱中4℃保存。溶胶一凝胶碳糊电极的制作及参数的优化设计8因素10水平的实验方法，并结合电极的响应灵敏度来确定酶电极制作中各组分最佳加入量，其中以反应完全、水解后呈均匀透明的溶胶、老化后呈粘稠状且均匀透明的凝胶、凝胶不干裂、滴膜光滑透明无裂痕、电极本底值最小及响应值最大作为评价溶胶和电极的标准。实验数据经过统计处理后得到试验范围内的最佳工艺条件为：水和TEOS的摩尔比4：2；乙醇体积为25；溶液pH值1．5；水解温度20℃；水解时间3h；老化温度20℃；老化时间2d。电极制作中溶胶-凝胶与缓冲溶液体积比为2：1。溶胶一凝胶固定酪氨酸酶电极工作条件的确定工作电位的选择采用制备的生物电极获得的循环伏安图如图1所示。根据所得的实验数据以及一些干扰离子的电位，确定本电极的工作电位为一100mV。溶液pH值和测量时间的选择电极响应与溶液pH值的关系见图2。在pH值约5．2时电极的响应值最大，考虑到酪氨酸酶的适宜pH范围为6．0～7．0，所以选择pH5．4作为操作条件。由溶胶一凝胶电极的时间响应关系确定，响应时间为3min，这时电极响应值可达95以上。电极性能测试检出限、线性范围及电极稳定性检出限根据信噪比S／N3来确定。相应实验数据列于表1。由表1的实验数据可以看出，电极在陈化一天后响应的灵敏度最高，但电极的稳定性不好，检测范围很窄；随着电极的使用，电极的稳定性和检出限都增大。其可能原因为随着电极表面在缓冲溶液中的浸润时间的增加和电极微表面的进化，校正了酶空间构型，使酶的活性中心外漏，易与底物接触，从而提高酶的活性。电极在使用24h后稳定性和检测范围都增加了，但其响应值有递减的趋势，这可能与溶胶一凝胶对酶活性的影响有关，或者由于电极表面有其它物质(如醌氢醌)覆盖而受到抑制。精密度和准确度标样和样品浓度分别为1．O0×10mol／L和5．O0×10一mol／L。在工作电位一100mV，pH5．4，响应时间3min的条件下进行测定，电极在同一底物中6次试验结果的RSD为1．04，标样与样品测定值之间的相对误差为0．002。溶液中酚的测定对溶液中各种酚类进行了测定与比较，其结果列于表2。可以看出，国家标准方法(分光光度法)仅能测定苯酚、邻甲酚、间甲酚，无法测定其它酚类。本法对苯酚、邻甲酚、对氯苯酚、邻苯二酚、间甲酚响应较好。电极抗干扰能力和对化工废水分析生物酶同含有苯及苯系物的化工废水接触将很快失活，实验采用溶胶一凝胶法在碳糊中固定生物酶制备生物传感器，解决了此问题。用本法对有苯及苯系物的含酚1．00×10一mol／L的化工废水进行了分析，结果显示，测定值与参考值之间的相对误差为0．007-0．053％。2.2硅溶胶-凝胶包埋纳米金和酶的葡萄糖生物传感器参考文献［12］方法，将Ｎａ２ＳｉＯ３·９Ｈ２Ｏ置于烘箱里，１２０℃下放置约１２ｈ，得Ｎａ２ＳｉＯ３·３Ｈ２Ｏ，完全冷却后用３ｍｏｌ／Ｌ的盐酸溶液调节比重到１.３８，过滤后得到澄清的水玻璃溶液。取出１ｍＬ用水１∶１（体积比）稀释，再经过磺酸基型阳离子交换柱后，得到ｐＨ＝１.５的硅溶胶，备用。酶电极的制备金电极（直径为３ｍｍ，实验室自制）用６.２５μｍ的细砂纸湿磨电极，０.３μｍ的三氧化二铝粉抛光，随后依次用无水乙醇、亚沸水超声洗涤５ｍｉｎ，最后将电极放在０.０５ｍｏｌ／Ｌ的硫酸底液中，在－０.２-１.３Ｖ的电位范围内，以０.２Ｖ／ｓ的扫描速率进行电化学预处理，至稳定的循环伏安曲线（通常为１０ｍｉｎ），备用。将预处理后的金电极浸入０.３０ｍＬ硅溶胶、０.２５ｍＬＧＯＤ（２０００Ｕ／ｍＬ）、０.１５ｍＬＬ半胱氨酸（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、０.２０ｍＬＰＶＡ（质量分数为）、０.１０ｍＬ金溶胶的均匀混合液中，约３０ｓ后取出，在４℃下放置１２ｈ后得到酶电极。酶电极的电化学行为各电极在磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安曲线如图１所示。由图１可知，裸Ａｕ电极（曲线ａ）和不加酶的修饰电极（曲线ｂ）没有电化学响应，而酶电极（曲线ｃ）出现了一对准可逆的氧化还原峰，在扫速为０.１Ｖ／ｓ时，其氧化峰电位为０.２２Ｖ，还原峰电位为０.０２Ｖ，这应该是葡萄糖氧化酶在电极表面发生电化学反应产生的。其氧化还原峰峰电流基本相同，因此，该反应是准可逆的直接电化学反应，式量电位约为０.１２Ｖ。与Ｎａｆｉｏｎ固定的电极相比较［13］，其式量电位显著正移，这可能是在金纳米粒子的表面形成了氧化物从而起到了一种潜在的促进剂作用［１４，１５］。酶电极的氧化峰电流和还原峰电流均随电位扫描速率的增加而增大，二者在０.的扫速范围内呈良好的线性关系。随扫速的增加，阴极峰电位负移，阳极峰电位正移，电极过程可逆性变差。溶液的酸度会影响固定化ＧＯＤ的活性，同时影响有质子参与的催化氧化过程。随着缓冲溶液ｐＨ的增加，式量电位呈线性下降，斜率为－５４ｍＶ／ｐＨ。图２说明了检测底液ｐＨ对传感器循环伏安阴极峰电流的影响。在ｐＨ＝７时，酶电极的电化学活性最高。酶电极制备条件的优化本文采用硅酸作为溶胶凝胶的前驱体，与采用烷基硅的前驱体相比，避免了乙醇的产生，有利于酶活性的保持。硅溶胶凝胶膜的孔径在１０ｎｍ左右，因此，本实验采用平均粒径为３０ｎｍ的金纳米粒子，可保证纳米粒子在膜中的固定而不流出。图３为金纳米粒子的紫外可见光谱图和透射电子显微镜图。当每毫升混合溶液中金溶胶的量大于０.０２ｍＬ时，可得到稳定的电流响应。电极的酶负载量是一个极重要的因素。图４为不同酶固定量与阴极峰电流的关系。从图中可看出，当体系中ＧＯＤ含量在５００Ｕ／ｍＬ时，酶电极的峰电流响应最大。本实验采用加入５００Ｕ／ｍＬ的ＧＯＤ。Ｌ-Ｃｙｓ的浓度也显著影响酶电极的电流响应。图５为体系中加入Ｌ-Ｃｙｓ对酶电极阴极峰电流的影响。随着Ｌ-Ｃｙｓ浓度的增加，峰电流随之增大，浓度达到１.８ｍｍｏｌ／Ｌ后趋于稳定。Ｌ-Ｃｙｓ的加入，可通过自组装的方式在电极与酶之间形成一座桥梁，有利于酶与电极间的电子传递。因此，本文中加入Ｌ-Ｃｙｓ量为１.８ｍｍｏｌ／Ｌ。酶电极对葡萄糖的安培响应为了考察固定在电极表面的ＧＯＤ是否保持其生物电催化活性，本文研究了酶电极对葡萄糖的电化学响应。图６为典型的酶电极对葡萄糖的电流与时间响应曲线。传感器对葡萄糖的响应时间小于５ｓ，说明该反应是一个快速过程。这可能硅溶胶凝胶薄膜是多孔网状结构，金纳米粒子的加入有利于酶在电极表面的取向并增加了导电性，有利于酶与电极间的电子传递作用。传感器对葡萄糖的线性响应范围为０.０２～２ｍｍｏｌ／Ｌ，线性回归方程为Δｉ（μＡ）＝０.００２＋０.０７８７ｃ（ｍｍｏｌ／Ｌ），检出限为５μｍｏｌ／Ｌ。检测灵敏度与酶介体型葡萄糖氧化酶电极［16］相近，优于金纳米粒子固定的葡萄糖氧化酶电极［17.18］。抗干扰性能葡萄糖生物传感器在测试血液样品时，主要的干扰可能来自具有电化学活性的抗坏血酸和尿酸。该酶电极的工作电位低（－０.１Ｖ），因此具有很高的选择性，对于０.１ｍｍｏｌ／Ｌ的葡萄糖，同样量的抗坏血酸和尿酸均不产生明显的干扰。酶电极的稳定性与重现性取５支不同修饰的酶电极对０.２ｍｍｏｌ／Ｌ的葡萄糖溶液进行测试，相对标准偏差ＲＳＤ为６.７％。同一酶电极对０.２ｍｍｏｌ／Ｌ的葡萄糖溶液平行测定９次，标准偏差ＲＳＤ为３.９％。当酶电极在４℃下保存，并间断使用１００ｄ后，该电极对葡萄糖的响应仍保持初始响应的９２％。电极稳定性显著优于文献报道［７，８］的３０ｄ和１４ｄ。说明葡萄糖氧化酶与金纳米粒子同时固定于硅凝胶的三维网络结构中，可很好地保持酶的催化活性。样品测试采用标准加入法测定血清样品中葡萄糖的浓度，测得值与健康人体血液中的正常值相符，回收率在９３％～１０２％之间。3溶胶一凝胶血红蛋白电化学传感器的研制玻碳电极的处理将玻碳电极用氧化铝粉抛光，在二次水和无水乙醇中分别超声洗涤5min，并重复3次，然后进行电化学活化处理，即在0．5mol／L的H2SO4中于一O．3V～1．5V进行循环伏安(CV)扫描，直到获得稳定的循环伏安响应．储备液的配制血红蛋白(Hemoglobin，Hb)储备液：称取50mg牛血红蛋白，用水稀释，并定容至1Oml的容量瓶中，避光4℃保存，使用时逐级稀释．溶胶一凝胶储备液：在室温下将1ml正硅酸乙酯，0．2ml0．1mol／L的HC1和3ml水、1Oml乙醇混合于20ml密封瓶中，超声震荡30min，至形成均一溶胶液，密封存放于阴暗处．表面活性剂储备液：称取0．25g十六烷基三甲基溴化铵，加10ml乙醇溶解，用水定容至25ml，密封保存．Hb／Sol—Gel／GC修饰电极的制备取配制好的溶胶一凝胶储备液和表面活性剂储备液各1ml，搅拌均匀后加入0．5ml血红蛋白(Hemo—globin，Hb)储备液，置于一密闭容器中超声震荡5rain，使其分散均匀．吸取8L该溶液，均匀涂敷在玻碳电极表面，置于4℃冰箱中干燥10h以上，即可制得Hb／Sol—Gel／GC修饰电极．该电极不用时可将其置于邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH一6)中并放入4℃冰箱中保存．相同条件下制备Sol—Gel／GC电极作为比较电极．电化学实验采用三电极体系：Ag／AgCl(饱和KC1)电极为参比电极、铂丝为辅助电极、Hb／Sol—Gel／GC修饰电极为工作电极；缓冲液为邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH一6)．实验时先向溶液中通氮气10min，并保持缓冲液在实验过程中的氮气气氛．Hb和Sol—Gel的紫外一可见吸收光谱用紫外一可见吸收光谱考察了Hb在溶胶一凝胶溶液中的吸收曲线，结果如图2所示．其中图2a为溶胶一凝胶溶液的Soret吸收带曲线，图2b为Hb的Soret吸收带曲