灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧化生物活性研究

安徽大学江淮学院本科毕业论文（设计）题目：霍山灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧化生物活性研究学生姓名：刘巍学号：22124019系别：理工部专业：生物信息技术入学时间：2012年9月导师姓名：吴庆喜职称/学位：讲师/博士霍山灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧化生物活性研究摘要目的：探究霍山野生灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞（3T3细胞）抗氧化生物活性的影响，证明霍山野生灵芝多糖可以保护细胞氧化损伤。方法：实验以3T3细胞为研究对象，首先用MTT法检测不同浓度叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导作用下3T3细胞的相对存活率，接着用MTT法测定不同浓度的野生灵芝多糖对t-BHP诱导作用下3T3细胞的保护作用。结果：t-BHP诱导组的细胞存活率比较低,当t-BHP浓度为200μg/ml时，细胞存活率降至75.56%，并且随着t-BHP浓度的增加呈负相关，当t-BHP浓度为800μg/ml时，细胞存活率低至38.09%。与t-BHP诱导组相比，当灵芝多糖浓度为200μg/ml，粗多糖处理组的细胞存活率从56.41%提升至61.98%，而且随着多糖浓度的增加呈正相关。结论：根据得到的结果可以说明霍山野生灵芝多糖可以在一定程度上提高细胞的存活率，保护细胞氧化损伤。关键词：霍山野生灵芝；抗氧化性；多糖AntioxidantactivitystudiesofcrudepolysaccharidesfromHuoshanwildGanodermalucidumontheembryonicfibroblastsofmouseAbstractObjective:ToexploretheantioxidantactivityofHuoshanwildGanodermalucidumpolysaccharidesontheembryonicfibroblasts(3T3cells)ofmouse,toproveHuoshanwildGanodermalucidumpolysaccharidescanprotectthecellsfromoxidativedamage.Methods:The3T3cellswereusedasthemodel,firsttherelativesurvivalratesoft-butylhydroperoxide(t-BHP)inducedweremeasuredbyMTTassaywithdifferentconcentrations,andthenmeasuredfordifferentconcentrationsofwildGanodermalucidumpolysaccharidesontheMTTassayt-BHPundertheprotectiveeffectinduced3T3cells.Results:Theresultsshowedthatt-BHPinducedcellviabilitygroupwasrelativelylow,andast-BHPwasnegativelycorrelatedwithincreasingconcentration.Andt-BHPinducedgroupcomparedwithcellviabilityHuoshanwildfunguspolysaccharidetreatmentgroupwashigher,andwiththeconcentration’sincreaseofthepolysaccharideitwaspositivelycorrelated.Conclusion:Accordingtotheresults,HuoshanwildGanodermalucidumpolysaccharidescouldimprovethesurvivalrateofthecellstoacertainextent,protectingthecellsfromoxidativedamage.Keywords：Huoshanwildfungus；Anti-oxidation；Polysaccharides目录1.前言······························51.1灵芝的研究现状·······················51.2灵芝多糖的研究现状·····················51.2.1灵芝多糖分离纯化的研究现状··············51.2.2灵芝多糖的生物活性研究现状··············61.3细胞氧化损伤和细胞抗氧化研究进展··············71.3.1细胞氧化损伤的危害··················71.3.2细胞抗氧化的研究进展·················72.材料、试剂和仪器·······················82.1实验材料··························82.2实验试剂··························82.3实验仪器··························83.实验方法···························83.1试剂的准备·························83.2灵芝粗多糖的提取······················93.2.1灵芝粗多糖的提取流程图················93.2.2灵芝粗多糖的提取步骤·················93.3细胞培养与诱导······················103.4MTT法检测························103.4.1MTT法原理·····················103.4.2MTT法检测过程···················104.结果与分析·························114.1MTT法检测t-BHP对3T3细胞的毒性·············114.2霍山野生灵芝粗多糖对t-BHP作用下的3T3细胞的保护作用···125.结论和展望·························13参考文献····························14致谢······························155霍山灵芝粗多糖对小鼠胚胎成纤维细胞的抗氧化生物活性研究1.前言1.1灵芝的研究现状我国的天然中药不仅药源丰富，且不良反应轻微，有安全低毒、价廉高效等优点，具有良好的研究开发前景。灵芝多糖是目前临床应用较为广泛、研究比较深入的中药之一，其为灵芝中最重要的天然有效成分之一，因其具有抗氧化、清除自由基、抗炎、提高免疫功能等广泛的生物学活性，近年来越来越受到学者们的重视。其中，灵芝多糖较好的抗氧化及抗肿瘤作用倍受人们的关注。灵芝是担子菌纲,多孔菌科,是一种食药两用真菌。我国应用灵芝作为药物历史悠久已有两千多年的历史了。历代医学家都认为灵芝是扶正固本,滋补强壮的珍品,能治疗多种疾病，对全身五脏之气均有补益作用。过去,天然灵芝产量较少,灵芝的研究和应用受到限制。现在由于能广泛对灵芝子实体和深层发酵菌丝体进行人工培养,可大规模生产,极大地促进了灵芝的研究和应用。对灵芝的研究表明,灵芝的组成成分复杂,具有多种有效成分和广泛的生物学作用,能治疗多种疾病。研究证明,灵芝含有多糖、氨基酸、蛋白质、甾类、萜类、有机酸、生物碱、多种酶和无机离子等多种大小不一的化合物。近年来研究发现，灵芝中除黄酮等小分子化合物具有较强的生物活性外，大分子化合物如灵芝多糖也同样具有多方面的活性。灵芝多糖是灵芝中重要的天然有效成分一，随着近年对其研究的不断深入，灵芝中的各种化合物药理作用越来越清晰。越来越多的研究表明，灵芝中的多种化合物具有强烈的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖及免疫活性作用。1.2灵芝多糖的研究现状灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，近年来以其独特的保健功能成为研究的热点。本世纪50年代末期以来,由于人工栽培灵芝子实体获得成功,随后又发展了深层发酵培养灵芝菌丝体和发酵液的技术,灵芝的开发应用日益广泛。对灵芝类真菌的化学成分、药理作用和作用机制以及临床应用进行了大量的研究,并取得了重大进展。这些研究表明灵芝多糖是灵芝的主要有效成分之一,具有抗肿瘤、增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老、抗氧化等多种生理功效。1.2.1灵芝多糖分离纯化的研究现状灵芝多糖是研究比较多而且透彻的多糖之一，在国际上，韩国、日本、美国等国家都掀起过研究灵芝多糖的热潮。灵芝多糖的提取一般采用非热水以及稀碱溶液，零食多糖的提取应避免在强酸、强碱溶液中进行，否则极易造成灵芝多糖中糖苷键的断裂或者构想发生变化。目前,常见的灵芝多糖主要可分为水溶及碱溶两种。灵芝多糖的分离和6纯化大致经过热水浸提、乙醇沉淀、透析及柱层析等步骤。在分离纯化灵芝多糖时多通过法及酶结合法去除粗多糖中的蛋白成分。根据来源不同,灵芝多糖可分为四种,即子实体多糖、孢子多糖、菌丝体多糖及发酵液多糖。虽然它们在具体的提取方法上不尽相同,但都是利用多糖易溶于热水而不溶于有机溶剂的性质进行提取的。提取子实体、孢子粉或菌丝体中多糖,需要加水或碱液浸提,浓缩后用乙醇沉淀出多糖，发酵液中多糖只需将发酵液浓缩后,直接加入数倍体积高浓度乙醇即可析出。1.2.2灵芝多糖的生物活性研究现状多糖具有多种生物学功能，目前对多糖的生物学活性研究主要集中在其免疫调节作用、抗肿瘤活性、抗病毒和降血糖降血脂以及抗氧化方面。（1）免疫调节作用免疫是机体抵御外界刺激保护机体的一种自身防御作用。灵芝多糖对免疫系统的调节作用是当前研究的一大热点。实验证明，多糖可以通过提高白细胞数量、刺激白细胞分化成熟和繁殖、增强巨噬细胞吞噬能力和分泌能力、调节细胞因子的表达等来增强机体的免疫力。（2）抗肿瘤作用研究表明很多植物多糖和真菌多糖具有抗肿瘤的作用。灵芝多糖作为抗肿瘤药物，具有来源广，毒副作用少，安全性高等优点，近年来已得到广泛的研究应用。多糖抗肿瘤的主要作用机理为:①激活机体的免疫受体，提高机体免疫功能;②改变细胞膜的结构提高膜上唾液酸含量，降低膜磷脂含量，抑制肿瘤增殖;③灵芝多糖通过减少或防止羟基自由基产生，使细胞分裂发生抑制以致肿瘤生长受到抑制。（3）降血糖作用近年来发现大多数灵芝属真菌多糖具有很好的降血糖功效，并可通过不同的途径发挥降血糖作用，包括通过促进胰岛素的分泌、改善胰岛素抵抗、加速肝葡萄糖代谢及外周组织对葡萄糖的利用、减少对葡萄糖的吸收等途径发挥降血糖作用。（4）抗菌抗病毒作用抗菌抗病毒作用主要为一系列硫酸酷多糖所具有，近年来硫酸酷多糖的这一作用引起人们的广泛关注。其主要抗病毒机理可能有以下两个方面:一是直接杀伤病毒;二是吸附在细胞表面，阻止病毒进入细胞。（5）抗氧化作用细胞的氧化损伤主要是由线粒体在电子传递的过程中产生的自由基所引起的，机体在生命过程中无时无刻不在产生自由基。正常情况下，体内存在抗氧化系统对氧自由基生成具有清除和平衡作用，这样对于机体来说是有利的，适量氧自由基对细胞的分裂，生长，消炎，解毒等起积极作用。但当体内蓄积过量自由基时，损害细胞膜上的脂类和蛋白质等，就会导致细胞衰老继而影响到机体的衰老，甚至还会引起许多病症。紫外线及其他辐射、疾病等都可能导致自由基大量产生，这时就需要外源抗氧化物质的摄入，7而某些具有抗氧化作用的中药因其低毒性正被广泛研究。这些多糖类物质可直接清除体内过剩自由基，或通过增强体内抗氧化酶活力起增强抗氧化作用，有效地防止或减轻由于体内自由基过剩所导致的氧化损伤，增强机体免疫能力，延缓衰老。因此研究多糖制剂对预防疾病有重要意义，可以延长动物最长寿命和平均寿命，降低中老年人心血管疾病的风险。1.3细胞氧化损伤和细胞抗氧化研究进展1.3.1细胞氧化损伤的危害人类是由细胞组成的。人体内产生的活性氧和自由基会使细胞受到氧化损伤，结果导致机体产生心血管疾病、肿瘤和衰老。正常情况下，机体内存在活性氧和自由基的清除系统，能够保证活性氧和自由基能够在一个极