森林冬虫草治疗白血病的研究

森林冬虫草治疗白血病的研究白血病是造血系统的恶性肿瘤，治疗方法包括联合化疗、放射治疗、免疫治疗或骨髓移植等，这些治疗方法或在杀伤肿瘤细胞的同时，也损伤了机体正常细胞，或费用昂贵，所以研究抑制白血病细胞增殖或诱导其向正常成熟细胞分化的药物，成为治疗研究的热点。研究表明，白血病细胞K562细胞可在不同的分化诱导剂作用下分别向巨核细胞系，红细胞系及巨噬细胞系分化【5-7】，白血病细胞HL-60细胞在分化诱导剂的作用下能向中性粒细胞及单核细胞分化【8-9】。森林冬虫草是一种冬虫草新种，含有冬虫草稀有的水溶性虫草多糖。我们对森林冬虫草抗生素及其胞外水溶性虫草多糖(CDP)进行研究，证明它们有清除自由基和抗辐射、抗癌的作用及免疫调节能力。基于森林冬虫草胞外水溶性虫草多糖CDP的抗癌、抗辐射及免疫调节等作用，本研究探讨CDP对白血病细胞K562和HL-60的诱导分化作用，旨在为临床用药提供实验依据。实验研究表明，森林冬虫草水溶性多糖CDP(1000mg/L)不但可显著诱导人红白血病(慢性髓细胞白血病)K562细胞向红细胞分化，而且也可以诱导人早幼粒白血病HL-60细胞向粒细胞分化。下面为实验过程及步骤：1材料和方法1.1材料RPMI1640购于GIBCO公司，森林冬虫草水溶性多糖CDP由野生森林冬虫草提取、鉴定，Nikon倒置荧光显微(TE2000-U)及摄影系统，LD4-2A型低速离心机。1.2方法1.2.1K562细胞诱导分化将人红白血病K562(慢性髓细胞白血病)细胞悬浮于完全RPMI640培养基中，内含10%新生小牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素，在37℃、5%CO2培养箱中传代培养。将生长良好的细胞制成6×105/ml细胞悬液，接种于24孔板中，每孔1ml，每平行3孔为1组，分别加1ml不同浓度的诱导分化剂(CDP终浓度分别为1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L)，阳性对照加2%的二甲亚砜(DMSO)1ml，阴性对照加RPMI16401ml，置于37℃、5%CO2培养箱中2d后，每组取少量细胞悬液(50μL)用台盼蓝染色法计数死活细胞数，剩余细胞悬液(1950μL)离心10min，取细胞沉淀20μL，加血红蛋白转化液(文齐氏液)5ml,转化5min，于血红蛋白仪上测血红蛋白值。1.2.2HL-60细胞诱导分化将人早幼粒白血病HL-60细胞悬浮于完全RPMI1640培养基中，内含10%新生小牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素，在37℃、5%CO2培养箱中传代培养。将生长良好的细胞制成2×105/ml细胞悬液，接种于24孔板中，每孔1ml，每平行3孔为1组，分别加1ml不同浓度的诱导分化剂(CDP终浓度分别为1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L)，阴性对照加RPMI16401ml，置于37℃、5%CO2培养箱中作用2d后，同法离心，取细胞沉淀涂片，迅速风干，瑞氏染色，显微镜计数200个细胞，观察细胞分化程度。1.3判断指标柑橘每孔活K562细胞数、死K562细胞数计算细胞存活率【细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%】，根据血红蛋白仪检测值计算每106个K562细胞所含血红蛋白量，根据分类计数结果计算HL-60细胞分化率。1.4统计学分析采用SPSS13.0软件进行数据统计分析。实验数据以x±s表示，实验组与对照组用Dunnett-t检验，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。2结果2.1CDP对K562细胞存活率及血红蛋白含量的影响台盼蓝染色观察K562细胞，随着诱导分化剂(森林冬虫草水溶性多糖CDP)浓度的增高，细胞存活率逐渐增高，细胞内血红蛋白含量也逐渐增加，其含量可达到阴性对照的2倍，阳性对照的1.6倍，见表1。表1不同浓度CDP对K562的细胞存活率和血红蛋白含量的影响组别CDP(mg/L)细胞存活率(%)血红蛋白(mg)阴性对照组074.600±3.4660.091±0.020阳性对照组1%DMSO78.100±1.7450.148±0.005(1)CDP处理组146.400±2.709(1)0.093±0.0041053.200±0.026(1)0.118±0.00410058.100±1.863(1)0.133±0.005(1)100092.800±1.601(1)0.188±0.020(2)与阴性对照组比较，(1)P＜0.05，(2)P＜0.012.2CDP对HL-60细胞形态学的影响在液体培养基条件下HL-60细胞多为原始细胞，呈圆形或椭圆形，大小不一，核为圆形或椭圆形，核染色质疏松细致，核浆比例大，几乎没有分化细胞。经CDP处理后，细胞形态学上趋于分化成熟，表现为胞浆增多，核浆比变少，核仁减少或消失，核染色质变粗糙，有空泡，呈网状，细胞核出现肾形，马蹄形。见图1.分化细胞百分率增加，见表2。表2不同浓度CDP作用下HL-60细胞的分化率组别CDP(mg/L)分化细胞(%)阴性对照00.300±0.473CDP处理组14.600±0.476(1)107.300±0.721(1)10012.300±0.473(1)100025.300±0.943(1)(1)与阴性对照组比较，P＜0.013讨论细胞分化成熟障碍是肿瘤发生的主要机制，诱导肿瘤细胞分化是治疗肿瘤的关键。诱导肿瘤细胞分化的特点是不杀伤肿瘤细胞，而是诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常细胞。细胞的分化表现在形态和功能两方面，形态分化是细胞分化的重要标志之一，它能客观地反映诱导分化剂对细胞诱导分化的作用。人红白血病K562细胞是Lozzio等【10】从慢性髓细胞性白血病患者的胸膜渗出液中分离培养建立起来的白血病细胞系，其在四氮唑蓝(NBT)，六亚甲基二乙酰胺(HMBA)及羟基脲的诱导下可分别向巨核细胞系，单核细胞系及红细胞系分化【5-7】，是当今研究诱导白血病细胞分化及探讨其分化机制的理想细胞模型。K562细胞丧失分化的能力及在不同诱导剂作用下可向不同细胞系分化的分子机制仍不十分清楚。本研究显示，经不同浓度CDP作用2d后的K562细胞趋于成熟，表现为CDP处理组细胞血红蛋白含量较阴性对照组含量增加，且细胞存活率随CDP浓度增加而升高，这些结果提示，CDP有诱导K562细胞分化成熟的作用。有研究证明，HL-60细胞在诱导剂的作用下能向中性粒细胞及单核细胞分化，分化细胞包括中幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状核粒细胞及分叶核粒细胞【8-9】。一般说阴性对照组的早幼粒细胞应在90%以上，诱导分化剂处理组细胞分化成熟程度越高，晚幼粒细胞、杆状核粒细胞及分叶核粒细胞所占比例越大，说明该诱导分化剂的效果越好。本研究显示，经不同浓度CDP作用2天后的HL-60细胞在形态学上有不同程度的趋于成熟细胞的表现，如胞浆增多，核浆比变小，核仁减小或消失，核染色质变粗，又空泡，呈网状，细胞核出现肾形、马蹄形。结果显示，CDP有诱导HHL-60细胞分化的作用。本实验研究表明，森林冬虫草水溶性多糖CDP(1000mg/L)不但可显著诱导人红白血病(慢性髓细胞白血病)K562细胞向红细胞分化，而且也可以诱导人早幼粒白血病HL-60细胞向粒细胞分化，其原理有待进一步研究。4参考文献【1】焦彦朝，梁宗琦，刘爱英。虫草生物活性物质研究概况。贵州农业科学，1990(3)：53。【2】梁宗琦，刘爱英，刘杰麟。虫草一新种及其绿僵菌无性型。真菌学报，1991(4)：257。【3】YenA,etal,12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)andstaurosporineinduceretinoblastomatumorsuppressorgeneexpressionwithmegakaryocyticdifferentiationofleukemiccells[J].CancerRes,1993(53)：3085-3091.【4】LamprontiI,etal.Accumulationofgamma-globinmRNAinhumanerythroidcellstreatedwithangelicin[J].EurJHaematol,2003(3)：189-195.【5】王振义，陈竺，肿瘤的诱导分化和凋亡疗法。上海：上海科技出版社，1989:32-33.【6】王志红，林著。小聚碱对HL-60细胞诱导分化及增殖抑制的作用。福建医科大学学报，2004(2)：135-138。