植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定

植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定一、实验原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1protein·h﹣1。二、仪器与用具冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。三、试剂1、提取缓冲液：0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg2+，2mmol/LDTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245gMgSO4·7H2O，0.1543gDTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05mol/LHCl调至pH8.0，最后定容至250ml；2、反应混合液A（0.1mol/LTris-HCl缓冲，pH7.4）：内含80mmol/LMg2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/LEGTA，称取3.0590gTris，4.9795gMgSO4·7H2O,0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/LHCl调至pH7.4，定容至250ml；3、反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4；4、显色剂（0.2mol/LTCA,0.37mol/LFeCl3和0.6mol/LHCl混合液）：3.3176gTCA（三氯乙酸），10.1021gFeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；5、40mmol/LATP溶液：0.1210gATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。四、方法1.粗酶液提取：称取植物材料1g于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g离心20min，上清液即为粗酶液。2.反应：1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7mlATP溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。3.粗酶液中可溶性蛋白质测定：取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质。4.原始数据记载5.结果计算：GS活力(A·mg﹣1protein·h﹣1)＝式中A—540nm处的吸光值；P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）；T—反应时间（h）。