植物组织培养中外植体褐变研究进展

植物组织培养中外植体褐变研究进展摘要：对导致植物组织培养中外植体褐变的主要影响因素进行了系统的分类和总结并简述了防止和减少褐化的相应途径以及非酶促因素对组培中外植体褐变的影响。旨在为该领域的深入研究提供系统的理论基础。最后对褐变研究的现实意义和应用产业化构想提出了见解。关键词：植物病理学；植物组织培养；褐变；多酚氧化酶；植物组织培养技术。褐变是植物组织培养中常见的现象。目前，在很多植物的组织培养中发现褐变现象的产生，尤以木本植物组织培养中褐变现象严重。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养时也时常发生。一般认为这是由于多酚氧化酶(PPO)被氧化成醌类物质，呈红褐色，并抑制许多酶的活性，影响植物材料的正常生长，严重时则导致培养物死亡。本文就近几年国内外植物组织培养中褐变产生的影响因素、褐变产生的机理及其防治措施等方面的研究进展进行综述。近30年来，组培技术大量应用于花卉生产、农作物栽培以及特种经济植物的幼苗、脱毒苗，使作物种植逐步走向集中控制化、规模化、自动化、不受自然影响的工厂化生产。尽管组织培养方面理论研究比较成熟，但在试验和生产过程中常常会遇到外植体褐变、污染和玻璃化现象这三大难题，而褐化能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在。褐化现象主要发生在外植体、植物愈伤组织的继代培养、悬浮细胞培养、花药培养以及原生质体的分离与培养中。褐化产物不仅使外植体、细胞、培养基褐变，而且抑制外植体正常的生理生化反应，影响外植体的生长与分化，甚至导致其死亡。所以，如何防止或减少褐变显得尤为重要。笔者总结最新褐变发生途径、产生机理，以期为植物组培技术的进一步完善提供理论依据。1褐变产生的影响因素植物组织培养过程中的褐变现象是由多种因素综合产生的结果，随植物的种类、基因型、外植体生长部位以及生理状态、培养及培养条件等的不同，褐变的程度也有所不同。外植体品种的选择。植物的基因型对外植体褐变发生频率、程度都存在根本性影响，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。这是由于基因会从根本上导致植物体内相关物质合成量有差异。在木本植物中，单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变HJ，这是由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素单宁或色素形成就多，而酚类化合物含量高将导致褐变的发生，因此，木本植物一般比草本植物更容易发生褐变。在植物组织培养中，不同物种之间褐化程度差异很大．就是同种植物的不同品种间也存在一定差异，在比较两类葡萄品种的褐变时，发现酚类物质含量与褐变发生具有正相关性。植物组织培养过程中的褐变现象是由多种因素综合产生的结果，随植物的种类、基因型、外植体生长部位以及生理状态、培养基及培养条件等的不同，褐变的程度也有所不同。1．1培养基状态液体培和半固体培养系统中，外植体溢出的有毒次级代谢产物可以得到充分的扩散，降低其浓度，因而对外植体造成的危害较轻，如果再加上滤纸做成纸桥，褐变抑制程度有所提高，这可能是滤纸吸附了少量有害的酚类物质。培养基中的琼脂含量降低，外植体褐变严重，培养基中水分含量相对增加，外植体褐变产生的鞣质具有一定的极性，更加易于溶出，毒害细胞，加重外植体的褐变。所以，为降低褐化程度，应该在允许的条件下，适当增加培养基的硬度，琼脂用量大，培养基硬度大，则褐变率低；随着琼脂用量的减少，培养基浓度减少，组织褐变加重。1.2无机盐在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高会引起酚类物质外溢，加剧褐变。降低盐的浓度，尤其是降低Mn2+和cu“等可作为氧化酶类的组成成分或辅因子离子的浓度，能够降低酶活性、抑制酚类氧化、减轻褐变旧。刘兰英等证实将DKW培养基的无机盐浓度减少1／2，核桃外植体的褐变率就由55．8％降至32．5％Ⅲo。赵鹂等认为较低浓度的无机盐含量，有利于防止植物材料褐化旧。；而钟士传等则认为，较高浓度的无机盐含量有利于防止褐化，所以无机盐含量的变化与褐化率未呈现比例关系旧1。马文卿等也证实，基本培养基为MS时褐化率最低，其次为I／4MS，I／2MS时褐化率达到最高‘“。所以盐浓度的高低与褐变没有明显正相关性，可能与其他影响因素相互制约，而在不同外植体中制约更加明显，从而表现出盐浓度高低与褐变程度的相关性。1.3植物激素不同植物分裂素和生长素能影响外植体发育和褐变酶活性，细胞分裂素BA或KIN具有使得PPO活性提高的作用。在柿树的组培中，用改良的MS培养基(ZT9．13tunoi／L，IAA0+57p,moi／L)能促进外植体的生长与分化，减轻外植体的褐变程度旧”。BAP(6一苄氨基腺嘌吟)或KT(激动素)能促进酚类化合物的合成，其浓度大小会影响多酚氧化酶的活性，而生长素类激素，如2，4一D可延缓多酚合成，减轻褐变发生灞J。pH值。培养基低pH值可降低多酚氧化酶的活性和底物利用率，抑制褐变H】。同时pH值影响细胞膜的渗透性，以及相应酶的活性，从而影响褐变。一般来说，较为酸性的环境可以减少褐变。在进行大白菜叶肉原生质体的培养中发现。褐变程度高的培养基，其pH值下降到5．0时，若提高外加新鲜培养基的pH值至6．5，可明显抑制褐变四。在水稻体细胞培养中，pH值为4．5—5．0时，Ms液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，而pH值为5．5—6．0时，愈伤组织严重褐变。1．4培养基添加物为减轻褐化程度，可向培养基内加入一些化学添加剂。一般有吸附剂、抗氧化剂、螯合剂和激活剂四大类。常用的吸附剂有AC(活性炭)和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，减轻褐变。粉末状与颗粒状AC相比，吸附性更强，一般在培养基中加入2—3∥L的AC。张红针对库拉索芦荟组培中的褐变现象，在培养基中加入活性炭500．0mg／L，环境温度控制在25℃，有利于减轻褐变。考虑到AC也吸附培养基中的生长调节物质，对外植体的生长带来竞争性抑制，应结合具体情况改变培养基的物质配比。Zaid认为，在加有AC的培养基中，生长调节剂的浓度应适当提高m】。最近，试验证明了PVP没有普遍防止褐变的效果，原因是植物体内存在着不同的酚类物质，而PVP也存在不同分子量的类型∞，这是由于PVP在吸附酚类物质时，具有较高专一性。在大花蕙兰试管苗增殖过程中的褐化研究中，选取AC和PVP2种抗氧化剂：Vc和硫代硫酸钠，结果表明，添加1500mg／L的AC效果最好，能够使得试管苗生长旺盛，保持较高的增殖系数。抗氧化剂可改变外植体周围的氧化还原电势，从而抑制酚类氧化、减轻褐变，例如vc(抗坏血酸)、NshS20，(偏二亚硫酸钠)、柠檬酸、二硫苏糖醇等。Vc为多羟基还原物质，在酶的催化下能消耗溶解氧，使酚类物质因缺氧而无法氧化m】，Vc也会影响多酚氧化酶的活性，从而阻止酚类物质氧化。在辣椒中加入Vc可明显减轻褐变程度m1，梅兴国等发现，在培养基中添加100mg／L柠檬酸可显著抑制红豆杉细胞褐变，且生长速率也高，Vc和半胱氨酸有一定的抗褐效果，但比二硫苏糖醇和柠檬酸差，Na2S20，的抗褐效果最差361。金属螫合剂(EDTA)中的Cu“从酶中螯合出来，形成稳定的螯合物，使多酚氧化酶失去活性。这是由于多酚氧化酶是一种含铜的蛋白质，其氧化活性依赖于铜的氧化还原作用m】。有报道指出，PPO在植物体内以潜伏态存在，其活性可以被SDS(十二烷基硫酸钠)或蛋白酶激活旧J。Cabanes等发现，SDS可以激活梨PPO活性旧o。陈冬茵等发现SDS也能激活蝴蝶兰PPO活性，其原因可能是酶蛋白与SDS结合使构型发生变化，导致活性增加Ⅲo。在试验操作中，可以结合这些化学添加剂的生理生化特性，在适当培养条件使用同一外植体培养基中，发挥抑制协同作用进而大大减轻褐化的程度。如杨薇红等在亚洲百合接种前用50mg／LVc浸泡外植体2h，并在之后的继代培养中加入150mg／LPVP，以抑制组培苗褐变现象的发生H。豆科植物和芸苔属植物在原生质体培养中容易发生褐变是一个普遍性问题，在芸苔及其衍生种或变种中的褐化问题尤为严重。在对橡胶树花药培养时发现，海垦2号花药的褐变较少，容易诱导愈伤组织，而有些花药则容易褐变，诱导愈伤组织比较困难。在组织培养外植体的选择上应注意此类问题。1.5外植体的生长部位以及生理状态在分别对辣椒下胚轴及子叶组织培养时发现，下胚轴具有较强的分生能力，整个外植体生长旺盛，其褐变程度低于子叶【2J2。在荔枝无菌苗不同组织的诱导实验中发现，茎最容易诱导出愈伤组织，且愈伤组织生长良好；叶大部分不能诱导出愈伤组织，诱导出的愈伤组织多中度褐变；根极大部分不能诱导出愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变3。产生这种情况的原因之一可能是不同生长部位，不同生理状态的外植体材料，酚类物质的含量及PPO的活性上有所差异。1．6培养基的成分对褐变的影响王永清等曾对樱花组织在不同培养基中生长状况进行比较发现，1／4MS在一定程度上能减轻樱花外植体的褐变。张妙霞等在进行柿树组织培养中发现，改良的MS培养基能促进外植体分化，减轻外植体的褐变程度[5]5。培养基中加入的生长调节物质不当，也会使外植体产生褐变。张卫芳等在对一年生薄壳核桃的茎尖培养中发现，随着培养基中6一BA浓度的升高，褐化率随之增高，褐化反应时间也提早；较低浓度的6一BA适宜茎尖的分化生长，褐化反应慢，部分培养基已无明显褐化现象；添加2，4一D、IAA的组合中，褐化反应稍有推迟№J。在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加lmg／LBA+0．5mg／L2，4一D时，愈伤组织比较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变，而培养基中添加lmg／LBA+lmg／L2，4～D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快l3|。以上说明，选择适当的培养基以及选择最佳的生长调节物质可以有效地克服褐变。培养条件对褐变也有所影响。培养条件如温度，光照等对褐变均有影响。温度过高或光照过强，都可以提高PPO的活性，从而加速被培养组织的褐变。c02浓度过高也会促进褐变。原因是环境中的C02向细胞内扩散，使细胞内积累过多的c03p，c032一与细胞膜上Ca2+离子结合而使有效Ca2+减少，导致内膜系统紊乱和瓦解，使得酚类物质与PPO相互接触，褐变就容易发生。1．7影响褐变的其他因素愈伤组织的继代、增殖方法对褐变有一定影响。在对低酚陆地棉愈伤组织继代培养时，将愈伤组织与其下胚轴一起转移至继代培养基上，它可以保持继续增殖生长，但如将愈伤组织与外植体切离后转移则易发生褐化现象。转瓶时间的早晚也是影响分化生长及褐变的因素。在对薄壳核桃的茎尖培养过程中，15d转瓶一次者，植株色泽正常，培养基中无浑浊物产生；25d转瓶一次者，植株色泽较为暗淡，培养基中有丝状浑浊物产生；30d转瓶一次者，植株色泽暗灰，生长缓慢，培养基较为浑浊，外植体基部产生的絮状物向四周扩散6。这可能是由于接种后转瓶周期时间长，伤口周围积累酚类物质过多所造成的。另外，培养基的硬度不适合或采取不适当的预处理都可能使培养材料的褐变重。光照影响。在自然光照条件下，生长的植物体内酶活性较高，外植体易褐变，当把母株放置在黑暗或弱光条件下生长，植株组织内光诱导的那些参与酚类合成与氧化的酶活性就大大减弱，酚类化合物的合成减少，其氧化产物酮类也相应减少，使褐蛮得到控制H1。吴永英等发现随着光照强度的增大，甜菜的褐变率明显上升ⅢJ。苹果、桃、葡萄、金缕梅和丝穗木等植物的茎尖外植体，如果取自田间自然光照下的植株枝条，接种后很容易褐变，而事先对取材母株或枝条进行遮光处理，之后再切取外植体，则可有效控制褐变。温度影响。温度对组织褐变影响比较大，从酶促反应的角度，其根本原因是植物体内酶活性和温度直接相关。低温不仅会降低相关酶(如PPO)的活性，从而抑制褐变，还可以抑制酚类化合物的合成，减少底物酚类氧化，进而减轻褐变。罗丽华等发现温度不同，酶的活性也不同，温度较低的情况下褐变明显减轻，19℃下较适宜板栗愈伤组织的培养。王明华等在褐变很严重的“芭蕾”苹果上验证了低温对褐变的抑制作用。lshii等研究发现卡特兰在15—25℃时褐变程度比25℃以上轻。过高的温度，不仅影响酶促反应的进行，