片仔癀对保护肝损害作用的研究

片仔癀对CCL4肝损害的保护作用研究（作者：姚大卫）编者按：中成药作为传统中医药的重要组成部分，为中华民族的繁衍生息、人类的身体健康做出了重大贡献。即使是在现代医学高度发达的今天，中医中药仍然如同璀璨明珠，大放异彩。中医中药的神奇疗效让人们把目光投向这块中华瑰宝。中药是中华民族的宝贵财富,中药现代化是中药科学发展的必由之路。为传承、发扬中医药文化，漳州片仔癀药业与香港中文大学姚大卫教授合作，开展片仔癀保肝作用机理的研究。该项目被列入香港创新及科技基金项目，是内地第一个中药品种被列入、并获得香港政府无偿提供的专项研究资金。片仔癀保肝研究取得积极成果，研究论文发表在世界著名的丹麦医学杂志《药理与毒理》，引起西方医学界的极大关注。研究证明：片仔癀对肝损害有显著的保护作用，且其保护肝脏的作用可能通过刺激肝细胞重要信号传导通道各种反应因子而产生。作者简介：姚大卫，英国皇家生物学院院士、英国皇家卫生学院院士、英国动物学院院士、美国解剖学院院士，香港中文大学生物医学学院终身教授。片仔癀对CCL4肝损害的保护作用研究摘要：目的探讨片仔癀对肝脏保护作用的机理。方法：以四氯化碳造成小鼠急性肝损伤为模型，观察片仔癀的保肝作用，并利用分子生物技术，通过肝细胞的培养来测定片仔癀对重要信号传导因子的作用，以了解片仔癀保肝作用机理。结果片仔癀可显著减轻四氯化碳对肝的损害，可显著降低其血浆ALT和AST水平，肝脏组织学改变明显减轻．能够刺激肝细胞使反应因子API、CRE、NFKB形成增加。结论片仔癀有明显的保肝作用，其作用机理可能通过调整肝细胞的重要信号传导通道的活动能力而取得的。关键词：片仔癀；保肝作用；机理i信号传导片仔癀主要由三七、蛇胆、麝香、牛黄组成，具有清热解毒、活血化瘀等功效。近几年国内外许多人应用片仔癀治疗急、慢性肝炎取得很好的效果，且最近对肝炎的治疗提出了新的中医观点：采用活血化瘀法进行治疗的原则，而片仔癀不仅是很好的活血化瘀药而且又有很好的利胆作用。为了考察其作用，以确证其疗效并运用分子生物技术研究其作用机理，为该药作用提供有力的依据，本文特对其保肝作用机理进行研究，现将研究结果报告如下。1试验材料1．1片仔癀由漳州片仔癀药业股份有限公司提供，用时研磨成试验所需的相应浓度的悬浊液，4℃贮存备用。1．2四氯化碳(CCL4)分析纯，临用时用豆油配成溶液，Dose：2.37mg/g1．3ASTandALT试剂Sigma公司。1．4测试ASTandALT仪器UV1601Spectrophotometer。1．5实验动物ICR小鼠由香港中文大学实验动物部提供，重约22～27gSPF级2实验方法2．1急性肝损伤取体重24～28g的雄性小鼠30只，实验前，小鼠禁食不禁水6h，按体重随机分成3组，每组l0只小鼠，分设空白对照组、CCL4组、片仔癀组(O.5g/kg)。片仔癀组每12h灌胃给药1次，每次灌胃容量均为0.1ml／10g，共绐药4次。空白对照组和模型对照组同时灌服等容量的生理盐水。在第三次给药后1h，除空白对照组小鼠外，其它两组小鼠按2μg/gb.w的CCL4腹腔注射5O%CCL4玉米油溶液。于12h后各组再给药1次。然后于ip.CCL4后24h，各鼠取血，测定血清ALT和AST，取肝脏作进一步处理。结果(见表1)取肝脏，从每个肝脏样品中各切出大约lcm大小的小块．立刻置于10%甲醛中，以备做切片。取这些小块在一系列升级酒精中脱水，之后在二甲苯中清洗。再把小块包埋在石蜡中，用切片机切成8μm厚的片段，用苏木精和伊红给这些片段染色。在显微镜下观察各鼠的肝细胞情况。结果见病理报告。图1小鼠肝细胞情况a正常组b片仔癀组cCCL4组d片仔癀组+CCL4组2．2利用分子生物学技术研究片仔癀对肝细胞的保护作用机理采用分泌碱性磷酸酶化验以测定片仔癀对肝细胞的反应因子形成的影响。片仔癀对肝细胞作用的传导剖面分析是用汞牌通道剖面系统铡定的。相关因素：API、NFκB、E—box、CRE、GRE、SRE和HSE，这些反应因子均和一个TAL的促进器和分秘碱性磷酸酶报告器相关连。把肝细胞播种在96格的培养盘中，通过LipofectAMINETM2000，把300ng每单位构成物与5OμL的DMEM培养基和0.4μL的LF2000混合传进培养盘的每室肝细胞中。传输物在传进培养盘24h后取出，一个培养盘加进新鲜的含有500μg/ml片仔癀的DMEM培养基，一盘加进新鲜的未含有片仔癀的DMEM培养基。培养48h后，25μL的表层浮物从96格的培养盘每格中取出。一套SEAP检测剂(Clontech)用来测定在表层浮物中的碱性磷酸酶的浓度。所有的化验均在一个白色96格的平底微滴定盘中进行。在每个25μL的表层浮物中加进25μL的稀释缓冲液并混合均匀，混合物在65℃孵化30min，加lmMMUP3μL继续在暗室室温下孵化60min，然后测定SEAP的能力。3、实验结果3.1片仔癀对小鼠CCL4急性肝损伤血清转氨酶的影响（见表1）如上表所示，CCL4模型组小鼠的ALT和AST异常升高，片仔癀0.5g/Kg对CCL4肝损害造成的转氨酶升高有显著的降酶作用。3.2片仔癀对CCL4急性肝损伤所造成肝组织病理变化的影响肝脏组织病理切片观察：CCL4模型组，肝中央静脉瘀血，周围有小叶中央性坏死，部分为小叶周围性坏死，呈点状和碎片状坏死，有灶性淋巴细胞等浸润；坏死周围有肝细胞重度浑浊肿胀、脂肪变性和气球样变性，汇管区有少量淋巴细胞等浸润，肝细胞的放射状排列被破坏。而片仔癀治疗组，被破坏的肝组织得到部分恢复，中央静脉周围肝细胞质红染，点状和碎片状坏死极少，大部分只表现有不同程度的肝细胞气球样变性，汇管区周围肝细胞有轻度浑浊肿胀，显示由CCL4引起的毒性已大大减少（见图1a、b、c、d）。3.3片仔癀对肝细胞重要信号传导通道各种反应因子的影响（见图2）。从上图所示表明，片仔癀500μg/ml能显著增加AP-1、CRE及NFκB反应因子水平，但对GRE、HSE、NFAT及SRE反应因子未能产生有意义的反应。4、讨论这个研究中，我们仔细观察了片仔癀对CCL4引起肝损伤的保护功能。组织观察显示CCL4引起肝脏细胞广泛的坏死变化，但若在小鼠受到CCL4侵害之前，给小鼠喂食片仔癀，这些坏死变化大大减少，研究结果表明片仔癀能够保护肝脏免受肝毒素的损害。肝功能测试也显示片仔癀能够保护肝脏：小鼠在受到CCL4侵害后，血清中的ALT和AST水平均异常地高，而预先喂食片仔癀的小鼠这种水平却大大降低。为了进一步了解片仔癀的保肝作用，我们用解剖技术研究了片仔癀对重要信号传导反应因子的影响，以便了解片仔癀治疗作用的分子机理。研究发现片仔癀能够刺激AP-1、CRE及NFκB反应因子，这些因子在细胞的活动中起着重要的调整作用。细胞质中NFκB转进细胞核总是和细胞生存相联系的。曾报道过在部分肝切除后NFκB受抑制导致肝细胞相分离和肝功能降低，因此片仔癀提升NFκB能力，可能是保护肝脏免受毒素损害的原因之一。AP1是异二聚物形态，由Fos和Jun族抄写因子成员间组成，现在研究发现AP1的活动能力对肝脏再生起着关键作用，片仔癀能够刺激AP1反应因子，这可能是保护肝脏免受CCL4损伤的另一个原因。CRE的作用目前还不清楚，有报道它其中一个功能是在肝再生过程中调节LDHA基因。总之，通过上面研究发现片仔癀能够对CCL4引起的肝损害有显著的保护作用，且其保护肝脏的作用可能通过刺激肝细胞重要信号传导通道各种反应因子而产生的。本实验由香港中文大学生物医学学院医学解剖系前主任、英国皇家生物学院院士姚大卫教授负责完成，本文系姚教授发表在著名国际医学学术期刊丹麦的《药理与毒理》杂志的中文翻译。