牛血液中SOD的提取分离纯化及鉴定

中央民族大学生命与环境科学学院生物化学实验综合性设计实验报告牛血中SOD分离纯化及含量、活性、相对分子质量的测定Theseparation,collection,purificationandidentificationofSODfromthecowblood姓名：唐胜华学号：0941063年级：09生科专业：生物科学小组成员：韩旭思关晴月指导教师：刘立亚2011年12月17日牛血中SOD分离纯化及含量、活性、相对分子质量的测定唐胜华韩旭思关晴月（中央民族大学北京市100081）摘要：目的熟练掌握从动物血液中提取SOD及分离鉴定和活力测定。方法破碎细胞释放其中的内涵物，有机溶剂去除血红蛋白，再用透析法纯化所得SOD，然后根据SOD的物理化学性质进行各项指标测定。结果实验中SOD在限制邻苯三酚自氧化的用量时随着提取纯化次数的增加而增加，PAGE电泳胶块染色和脱色后可以明显的发现胶块正中央有透明区域。结论动物血液中含有ＳＯＤ，它具有抑制氧化作用的功能。关键词：SOD，邻苯三酚自氧化，ＰＡＧＥ电泳，抑制氧化。Theseparation,collection,purificationandidentificationofSODfromthecowbloodTANGSheng-hua，HANXu-si,GUANQing-yue(MinZuUniversityofChina,CityofBeijing,100081)Abstract:ObjectiveFromtheexperiment,wecanknowexactlyhowtogetSODfromcowblood,thenseparate,collect,purifyandidentifyit.MethodswestartondeterminingthefeatureofSODafterextracting,separating,andcollectingit,thenwewillgetwhatwewantfromtheexperiment.Resultsthroughtheexperiment,obviouslythattheamountofPyrogallolusedtosuppresstheOxidationrateisincreasedwiththestepstoseparate,collect,purifytheSODincreasing.AlsowecanfindthatthereisaTransparencyinthemiddleoftheRubberblockaftertheElectrophoresisfinished.ConclusionsThroughtheexperiment,wedeeplyknowthatthereisalwayssomeSODintheanimalbloodwhichitselfcansuppresstheOxidationrateinthebody.Keywords:SOD,self-OxidationofPyrogallol,PAGEElectrophoresis,Oxidation-supression前言近年来，随着生物科学领域中分子生物学的迅速发展，使得之前只能从细胞层面研究血液组成及功能的瓶颈得以突破，进入研究血红细胞中分子组成的层次。由此，在大量实验中都存在着这么一种现象，红细胞中有某种组成成分能够抑制生物自氧化的速率，延缓细胞衰老和凋亡的时间。通过大量的实验证明，这种物质就是超氧化物歧化酶（又称SOD），是一种能专一地清除超氧阴离子自由基(O—2)的金属酶。按所含金属离子不同可分为Cu—Zn—SOD、Mn—SOD和Fe—SOD。SOD催化反应：2H++2O—2→2H2O2+O2。SOD对过量的O—2的及时清除保证了机体内O—2的含量相对平衡，对机体起防护作用。国内外研究表明SOD具有抗炎、抗衰老抗辐射等重要作用。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平、袁艺、赵文芝、余旭亚等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出SOD并进行相关研究。其提取方法因原材料的不同而不同，本实验通过对牛血红细胞中SOD的研究，证明SOD的生理作用以及影响其活性的因素，从而从更深层面上认知SOD的生理生化作用。1.材料和方法1.1实验材料与试剂新鲜牛血液（含有柠檬酸钠抗凝剂）1.1.1实验试剂0.6%的TritonX-100溶液，0.9%的生理盐水，4℃下预冷的95%乙醇，4℃下预冷的氯仿，丙酮，蒸馏水，2.5mmol/LpH7.6磷酸钾缓冲液，0.05mol/L邻苯三酚，10mmol/L的HCl溶液，考马斯亮蓝R-250试剂，100mg/mL的标准蛋白溶液。1.1.2电泳试剂PAGE电泳试剂：2.45*10-3mol/LNBT溶液，3.60*10-2mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，5*10-2mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液，40%蔗糖，0.14%过硫酸铵(AP)，20%的乙醇，7%的冰乙酸的水溶液，0.5mol/LNaCl水溶液，0.25%的考马斯亮蓝R-250染色液，含有50%乙醇和10%的冰乙酸的水溶液，浓缩胶缓冲液，分离胶缓冲液，样品溶解液，1*电极缓冲液，10%的（m/V）SDS贮液。1.1.3实验仪器10mL、25mL量筒各两个，烧杯，10mL的小试管10支，玻璃棒，冰箱，恒温水浴箱，10000道尔顿的透析袋，离心机（10、50mL的离心管），移液枪（10uL、50uL、200uL、1000uL）和对应枪头各一套，25mL、50mL、100mL容量瓶各一个，721分管光度计一台，垂直板电泳槽。1.2实验方法1.2.1牛血液中SOD的提取与分离纯化沉淀红血球：取配好的牛血液200mL(7份血液：1份柠檬酸三钠)，装入4个50mL的离心管中，,以4000r/min离心处理10min，吸除上清液(血浆)，收集下层红血球沉淀约100mL。低渗涨破细胞：把收集的血球加等体积0.9%的氯化钠溶液,以4000r/min离心处理10min,重复3次,得洗涤红血球。然后在洗净的红血球中加入等体积0.6%的tritonX-100溶液，在40C条件下,搅拌溶血30min,在0~40C下放置30min以上,使红血球充分破裂。沉淀血红蛋白：按溶血体积的0.25倍缓慢加入预冷至40C的95%乙醇,再按溶血体积的0.15倍加入预冷至40C的氯仿,搅拌15min,静置30min,4000r/min离心处理10min,收集上清液,弃去沉淀物（留样3.0mL测酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。SOD的再提纯：在上清液中加入K2HPO4.3H2O(43gK2HPO4.3H2O：100mL上清液)，充分搅拌，转移至分液漏斗，振摇后静置15min，室温下4000r/min离心10min，见明显的分层，收集含有SOD的上层乙醇-氯仿相（微显浑浊），室温下4000r/min离心20min，弃去沉淀，收集上清液约60mL（留样3.0mL测酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。沉淀SOD：像上一步得到的上清液中加入0.75倍体积40C预冷过的丙酮，出现SOD沉淀，室温下4000r/min离心20min收集灰白色的沉淀物。溶解沉淀：把沉淀物用2倍蒸馏水溶解,在650C的水浴中保温15min,迅速冷却至室温,4000r/min离心10min收集上清液,弃去沉淀物（留样1.5mL进行酶活和蛋白质浓度测定及电泳鉴定）。透析纯化：将剩下的溶解液，装入截留量为10000道尔顿的透析袋中，40C条件下于200mL浓度为2.5mmol/LpH值为7.6的磷酸缓冲液中透析，每隔0.5h换透析液一次，总共进行4次，若有沉淀，则4000r/min离心30min，弃去沉淀物，收集上清液（留样0.5mL测定酶活，蛋白质浓度及电泳鉴定）。1.2.2邻苯三酚法测定SOD活性，用分光光度计在波长为325nm下测其OD值邻苯三酚的自氧化率测定：取两支试管按下表1加入缓冲液（50mmol/LpH为8.2的Tris-HCl），于25oC保温20min，然后加入25oC预热过的邻苯三酚液，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325nm波长下测定A值，于恒温池中每隔30s侧吸光值一次。计算线性范围内每1min吸光的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在正好0.070A/min左右。注意，空白对照用10mmol/L的盐酸代替邻苯三酚。表1.邻苯三酚自氧化速率测定加样表Table1ThetableofhowtoaddtheSample试剂空白管自氧化管pH8.2的Tris-HCl缓冲液（mL）4.54.510mmol/L的HCl（uL）170—45mmol/L的邻苯三酚（uL）—170酶活性测定：按照下表2要求加样，测定操作同邻苯三酚自氧化速率相同，根据酶活性情况可以适当调整样品液加入量。表2.酶活性测定加样表Table2ThetableforhowtoaddEnzyme试剂对照管实验管pH8.2的Tris-HCl缓冲液（mL）4.54.5酶溶液（uL）-4045mmol/L的邻苯三酚（uL）-17010mmol/L的HCl（uL）170-酶活力计算：在规定条件下，1mL反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个酶活力单位，计算公式如下：SOD活力（U/mL）=[(0.070-A325)/0.070]*100%*V总*稀释倍数50%*V样V总—反应总体积；V样—加入样品液的体积。总活力（U）=单位体积活力*原液总体积1.2.3考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度绘制标准曲线：取六支试管编号，按照下表3要求加入试剂，盖上盖子摇匀，注意各管震荡程度尽量一致。放置10min。在595nm波长下比色测定光吸收值，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制曲线。表3.标准蛋白曲线测定加样表Table3ThetableofhowtoaddthesamplewhengettingtheCurveofstandardprotein试剂123456蛋白质标准液/mL00.20.40.60.81.00.9%的NaCl溶液/mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250/mL555555蛋白质含量/ug020406080100样品中蛋白浓度的测定：样品中蛋白浓度的测定。将待测的SOD溶解并稀释至一定的浓度，取1支试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝R-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。注意，也可以直接取用提取液，不进行稀释操作。结果计算：根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（ug）；样品（SOD）蛋白质含量=查到的蛋白质浓度（mg/mL）*提取液的体积(mL)/样品质量(g)*测定时提取液的体积(mL)酶比活力的测定=样品液中酶总活力/样液中蛋白质的含量1.2.3SDS-PAGE不连续电泳测定SOD的相对分子质量上样：安装垂直板电泳槽，用1%的琼脂糖封底，配制浓缩胶和分离胶，上样电泳，上样时取各步样液加入等体积的40%的蔗糖（含有少量的溴酚蓝）。每孔加入上述各步提取的SOD初提液及最终提取液15uL,以对称方式加样。电泳：连接电源，上槽接负极，下槽接正极，接通冷却水及电源开关，调节电流至15mA,待样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调节至20—30mA，当染料前沿距离硅橡胶框下缘1—2cm时，关闭电源，电泳结束，取出胶块，一分为二。染色和脱色：用0.05%考马斯亮蓝R-250（内含20%的磺基水杨酸）染色液染色，染色与固定同时进行，使染色液没过胶版，染色30min左右。脱色时用脱色液浸泡数次，直至背景色退去。1.2.4PAGE电泳鉴定SOD配胶方法同1.2.3所述，唯一的差别就是此处不加入SDS，其他操作也同SDS-PAGE。当电泳结束后，将胶块取出，进行活性染色观察。2.结果2.1邻苯三酚自氧化法测SOD酶活2.1.1邻苯三酚自氧化速率测定数据如下表4所示，为使得邻苯三酚的自氧化速率在0.070