您好,欢迎访问三七文档
当前位置:首页 > 商业/管理/HR > 资本运营 > 武威西门塔尔牛MSTN
甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因外显子遗传变异的研究孙雪婧1a,c,高雪晋1b,李积友2,杜晓华1a,c,刘霞1b,c,杨孝朴1a(1甘肃农业大学a动物医学院b生命科学技术学院c甘肃省草食动物生物技术重点实验室2甘肃省畜牧业产业管理局)摘要:为分析肉牛MSTN基因的遗传多态性及变异特征。采用PCR-SSCP方法检测了60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因的多态性,对群体内各等位基因进行了克隆测序。结果显示,武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子存在A、B两个等位基因以及AA、AB两种基因型,基因型频率分别为0.9167、0.0833;第2外显子存在A、B两个等位基因以及AA、BB、AB三种基因型,基因型频率分别为0.5、0.25、0.25。序列分析表明,武威西门塔尔牛MSTN第1外显子在269bp发生了A→G的突变和第2外显子在41bp发生了C→T的突变,均属于同义突变。(结论)统计结果表明,武威西门塔尔牛MSTN基因第一外显子呈低度多态,第二外显子呈中度多态,外显子3没有发生突变。关键词:MSTN基因;遗传多态性;西门塔尔牛PolymorphisminExonsofMSTNGeneinWuweiSimmentalAbstract:(Objective)InordertostudythepolymorphismandvariationinexonsofMSTNgenein60WuweiSimmental.(Method)DNAfragmentcontainingtheexonsofMSTNgenewasamplifiedandgenotypedusingPCRsingle-strandconformationalpolymorphism(SSCP)method.RepresentativeallelesweresequencedbycloningforverificationoftheirvariationsinDNAsequences.(Result)Theresultsshowedthatthepolymorphismintheexon1wascontrolledbyAandBalleleswhichformedtwogenotypesnamelyAAandABwithfrequenciesat0.9167and0.0833respectively;thatthepolymorphismintheexon2wascontrolledbyAandBalleleswhichformedthreegenotypesnamelyAA、BBandABwithfrequenciesat0.5、0.25and0.25respectively;thatthepolymorphismintheexon3wasonlycontrolledbyAallelewhichformedonegenotypesnamelyAA.SequenceanalysisindicatedthatthereissinglenucleotidemutationincludingAtoGat269stnucleotideintheexon1andsinglenucleotidemutationincludingCtoTat41stnucleotideintheexon2,noaminoacidchange;thatthereisnonucleotidemutationintheexon3.(Conclusion)Theoverallresultsshowedthatexon1ofMSTNgenehadalowlevelofgeneticdiversityin收稿日期:基金项目:甘肃省草食畜牧业发展行动—河西肉牛选育项目(2013)作者简介:孙雪婧(1987-),女,山东青岛人,在读硕士研究生,主要从事生物化学与分子生物学的研究。Email:544879429@qq.com通讯作者:杨孝朴(1962-),男,甘肃靖远县人,教授,硕士生导师,主要从事生物化学与分子生物学的研究。WuweiSimmental;thatexon2ofMSTNgenehadamiddlelevelofgeneticdiversityinWuweiSimmental.Keywords:MSTNgene;geneticpolymorphism;Simmental肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)又称生长分化因子8(Growthdifferentiationfactor8,GDF-8),是转化生长因子超家族中的一员,对肌肉的分化和生长有负调控功能[1]。研究发现该基因的缺失、插入或突变会引起肌细胞增生与肌纤维肥大,从而提高产肉力,表现出“双肌”性状[2],在肉用家畜的品种选育上有重要的作用。近几年来对MSTN基因的研究一直十分活跃,对牛、绵羊、山羊、猪、马等家畜MSTN基因的多态性都有相关的研究报道[3-5]。但有关西门塔尔牛MSTN基因的研究显见报道。甘肃省武威市为改良本地河西黄牛产肉产奶性能,从1980年开始引用乳肉兼用型西门塔尔牛冻精与本地牛进行杂交[6],为观察其后代的遗传稳定性,本研究采用PCR-SSCP方法对60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因进行多态性分析,探讨武威西门塔尔牛群体MSTN基因的分子遗传特性,为武威西门塔尔牛MSTN基因的分子生物学研究及其分子育种奠定基础。1材料与方法1.1血样采集随机选取甘肃省武威市60头西门塔尔牛,每头牛颈静脉采血10mL,ACD(酸性柠檬酸葡萄糖)抗凝,-70℃冻存备用。1.2主要试剂与仪器蛋白酶K、Tris平衡酚购自大连宝生物工程有限公司;丙烯酰胺、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)购自Amersco公司;过硫酸铵购自烟台市双双化工有限公司;去离子甲酰胺、TEMED购自sigma公司;甲叉购自上海生工生物工程股份有限公司;2×PowerTaqPCRMasterMix购自北京百泰克生物技术公司;DNAmarker购自上海捷瑞生物工程有限公司;其他常规试剂均为进口或国产分析纯级产品。梯度PCR仪为美国ABI公司生产;PROTEANⅡxiCell双垂直电泳槽、PowerpacUniversal电泳仪:美国BIO-RAD公司生产;F32加热/制冷循环仪:德国Julabo公司生产。1.3基因组DNA的提取用酚-氯仿法从血样中提取甘肃武威西门塔尔牛基因组DNA,-20℃冻存。1.4引物设计与PCR扩增参考GenBank中的牛(AC_000159)MSTN基因序列用在线设计引物软件Primer3.0设计3对引物,由北京六合华大基因有限公司合成,各引物序列见表1。表1武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的引物序列及预扩增片段长度Table.1primerinformationforthethreeexonsofMSTNgeneinWuweisimmentalbeefcattle外显子引物预扩增片段长度外显子1上游引物(F):5'-CCATGCAAAAACTGCAAATC-3'396bp下游引物(R):5'-TGCACCAGCAGGACTACTCA-3'外显子2上游引物(F):5'-CTGATCTTCTAACGCAAGTGGA-3'382bp下游引物(R):5'-TCACTTACCAGTCCATCTTCTCC-3'外显子3上游引物(F):5'-TTCTTTCCTTTCCATACAGACTCC-3'404bp下游引物(R):5'-GACCTCATGAACACCCACAGCGAT-3'PCR反应体系为20μl:7.4μlddH2O,引物F和R各0.4μl,2×PowerTaqPCRMasterMix11μl,0.8μl模板,反应条件:94℃预变性4min;94℃变性30s,外显子1、2、3的退火温度分别为57℃、56℃、58℃,退火时间为30s,共35个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.5SSCP检测取2μl的PCR产物加入8μl的变性上样缓冲液(980ml/L去离子甲酰胺,0.25g/L溴酚蓝,0.25g/L二甲苯青,pH8.0、0.01mol/LEDTA),105℃变性10min,立即冰浴10min。3个片段均用100g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr:Bis的质量比为39:1),胶浓度均为14%,电压分别为150V、180V、180V,电泳时间为24h、22h。22h,温度条件分别为4℃、10℃、10℃,银染法显色后拍照。将PCR产物送于北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。1.6数据统计分析利用DNAStar软件包中的EditSeq和MegAlign程序进行DNA序列的剪切校对、比对和翻译,碱基组成一致的序列判定为同种等位基因。基因型频率、基因频率统计和χ2检验、基因杂合度(Heterozygosity,He)及有效等位基因数(Effectivenumberofalleles,Ne)检测利用POPGENE(版本1.32)软件完成,多态信息含量(Polymorphisminformationcontent,PIC)利用PIC_Calc(版本0.6)软件进行分析。2结果与分析2.1PCR扩增甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因三个外显子扩增结果经琼脂糖凝胶电泳检测,与预期扩增片段的长度相符,且条带清晰明亮无杂带,可直接用于SSCP分析(图1)。M:AccurateRun100bp-IDNAladder;1-2:外显子1产物;3-4:外显子2产物;5-6:外显子3产物M:AccurateRun100bp-IDNAladder;1-2:PCRproductsofexon1;3-4:PCRproductsofexon2;5-6:PCRproductsofexon3图1武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的PCR扩增Fig.1PCRamplificationofthreeexonsofMSTNgeneinWuweiSimmental2.2SSCP检测SSCP分析结果显示,所检测的60头武威西门塔尔牛中发现第1外显子受A、B两个等位基因控制,存在AA、AB两种基因型;第2外显子受A、B两个等位基因控制,存在AA、BB、AB三种基因型;第3外显子只有AA一种基因型,无多态(图2)。图2A图2B图2A武威西门塔尔牛MSTN基因外显子1SSCP检测图2B武威西门塔尔牛MSTN基因外显子2SSCP检测Fig.2ADetectionofexon1ofMSTNgeneFig.2BDetectionofexon2ofMSTNgeneinWuweiSimmentalbySSCPinWuweiSimmentalbySSCP2.3序列分析对具有多态性的PCR产物进行测序,得到甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子396bp的核苷酸序列、第2外显子382bp的核苷酸序列和第3外显子404bp的核苷酸序列。外显子1中的AB型与AA型相比,AB型的核苷酸序列在第269bp处发生A→G突变(图3),密码子由GAA变为GAG,突变前后所编码的氨基酸均为谷氨酸,为同义突变。外显子2中的AB(BB)型与AA型相比,AB(BB)型的核苷酸序列在第41bp处发生C→T突变(图4),密码子由UGC变为UGU,突变前后所编码的氨基酸均为半胱氨酸,也为同义突变;第3外显子核苷酸序列没有突变。图3外显子1AA,AB基因型位于269bp处突变的测序峰图Fig.5Themutationin269bpofexon1betweenAAandABgenotype图4外显子2AA,AB和BB基因型位于41bp处突变的测序峰图Fig.6Themutationin41bpofexon2betweenAA,ABandBBgenotype2.4遗传多态性分析对60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因三个外显子的等位基因的基因型频率、基因频率进行了统计,并计算了其纯合度、杂合度和多态信息含量的值,结果见表2。表2武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的等位基因频率,基因型频
本文标题:武威西门塔尔牛MSTN
链接地址:https://www.777doc.com/doc-2307542 .html