染色体免疫共沉淀介绍

染色体免疫共沉淀染色体免疫共沉淀（Chromatinimmunop-recipitation，ChIP）是一种可在体内用来确定与某一特定蛋白结合或蛋白定位所在的特异性DNA序列的技术。染色质免疫沉淀技术是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。染色体免疫共沉淀的基本原理它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。免疫学方法在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proteinA”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的proteinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proteinA就能吸附抗原达到精制的目的。在免疫沉淀之前，通过甲醛作用使DNA和蛋白质发生共价连接，通过离心就可以得到DNA-蛋白复合体。免疫学方法的注意事项注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂。低温进行实验。ChIP的一般流程：甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。染色体免疫共沉淀的应用采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。表观遗传学的研究转录因子的结合和条件特异性；用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系，组蛋白修饰蛋白和染色体重建。染色体免疫共沉淀的应用CHIP可以检测体内反式因子与DNA的动态作用CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用谢谢！