明胶酶谱法

明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。Mmp-272kdmmp-992kd实验步骤1.取对数期的癌细胞在的C。2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm离心10min，-70℃储存备用。3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5%TritonX-100，50mmol/LTris-HCl，5mmol/LCaCl2，pH7.6)中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含TritonX-100外其余同洗脱液)漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液(50mmol/LTris-HCl,5mmol/CaCl2,0.02%Brij-35,pH7.6)中37℃孵育42h。6.孵育结束后经染色液(0.05%Coomassic亮蓝、30%甲醇、10%乙酸)染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10%、10%、5%)分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP-9（92KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。注意事项：1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。3.用大梳子4.孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。6.明胶要4度保存，配好后1周内使用试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10%SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）ddH2O4.5ml30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml1.5mol/lTris（PH8.8）2.5ml10%SDS100ul10%过硫酸铵（APS）100ulTEMED8ul1%明胶（1g明胶--100ml，37°C水浴溶解）0.5mlB.浓缩胶的配制浓缩胶6mlddH2O4.5ml30%储备胶0.75ml1mol/lTris-HCL(PH6.8)0.76ml10%SDS60ul10%过硫酸铵60ulTEMED6ul（3）5×Tris�甘氨酸电极缓冲液0.125mol/lTris-HCL，1.25mol/l甘氨酸，0.5%SDS（PH8.3）（4）4×上样缓冲液0.32%Tris-HCL6.4ml4%SDS（PH7.2）8ml16%甘油3.2ml溴酚蓝0.024gddH2O2.4ml(5)洗脱液:2.5%TritonX-100，50mmol/LTris-HCl6.057g/L，5mmol/LCaCl20.5549g/L，pH7.6（40分钟两次，中间换液）（6）漂洗液：50mmol/LTris-HCl，5mmol/LCaCl2，pH7.6（20分钟2次）（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）（8）染色液：0.05%Coomassic亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10%、10%、5%（分别30min、1h、2h脱色）