普通免疫学-8-2014-单克隆抗体.

普通免疫学(Immunology)抗体制备与抗原抗体反应及应用抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）基因工程抗体的制备主要的抗原抗体反应免疫学在生物学中的应用抗体的制备（多克隆与单克隆抗体）什么是多克隆抗体(polyclonalantibody，pAb)?抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。一个抗原上可以有许多不同的抗原决定簇，因而使机体产生许多不同的抗体。用包含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，也称为多克隆抗体。TheimmuneresponsetoanantigengenerallyinvolvestheactivationofmultipleB-cellsallofwhichtargetaspecificepitopeonthatantigen.Asaresultalargenumberofantibodiesareproducedwithdifferentspecificitiesandepitopeaffinitiestheseareknownaspolyclonalantibodies.可以制作“生物导弹”。多克隆抗体通常用兔制备的多克隆抗体通常用什么制备的?多克隆抗体具有异质性：如何表示？等电聚焦实验能揭示多克隆抗体中的各种抗体具有不同的等电点。等电聚焦实验：蛋白质在pH梯度胶中电泳，每个分子沿着pH梯度迁移至电荷为中性的相应pH位置，并在此点积聚。抗血清的缺陷：每一种抗血清都不同于其他任何的抗血清，即使选用遗传背景完全相同的动物，采用相同的抗原制剂和相同的免疫程序。产生的抗血清只能是有限的数量，因此同一份血清制剂不可能长期使用或完成一系列复杂的实验或临床检测。即使是用亲和层析技术纯化的抗体也可能包含少量引起交叉反应的抗体，干扰对实验的分析。怎么办?发展一种无限量能产生结构均一且已知特异性的抗体分子方法。1975年Kǒhler和Milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立起第一个B细胞杂交瘤细胞株,并成功地制得抗SRBC的单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）。迄今世界已研制成数以千计的McAb。fortheoriesconcerningthespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystemandthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodiesJerneKǒhlerMilsteinTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984由一种克隆产生的针对一种细胞表位的特异性抗体叫做单克隆抗体。MonoclonalantibodiesrepresentasingleBlymphocytegeneratingantibodiestoonespecificepitope.单克隆抗体为单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白，是一种独特型的抗体。它的特异性是针对一个抗原决定簇的。如何获得针对一种细胞表位的特异性抗体?问题一:有关单克隆抗体生产的实际问题?问题二:如何大量无限地生产单克隆抗体?选择什么样的细胞?生产单克隆抗体的原理骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，因此能在体外长期培养，但不能分泌特异性抗体；B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖，因此不能长期培养。免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。在制备杂交瘤过程中的一个问题是什么？如何解决？让未成杂交瘤的骨髓瘤细胞和脾脏细胞去死HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养。5-磷酸核糖焦磷酸尿嘧啶RNADNA次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶（T）氨基蝶呤（A）合成主要途径合成替代途径TKHPGRTHPGRT：次黄嘌呤鸟嘌呤核苷转移酶TK：胸腺嘧啶激酶未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成核酸的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤合成核酸而死亡。融合的杂交瘤细胞由于从脾脏细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。未融合的亲代脾脏细胞寿命有限，不久就死亡了。问题一三、单克隆抗体的制备过程杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括：（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；（4）细胞融合；（5）杂交瘤细胞的选择培养；（6）杂交瘤细胞的筛选；（7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定；（9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；（10）单克隆抗体的大量制备。1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成核酸而死亡。未融合的脾细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤－鸟嘌呤－磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。如何获得针对一种细胞表位的特异性抗体?问题一:4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌所需特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。（1）体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。（2）体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。鼠单抗也具有一些缺陷，主要是小鼠免疫系统不能识别某些免疫原。另一方面，由于多克隆抗体识别的是抗原的多个抗原决定簇，同时抗体的亲和性要远远高于鼠来源的抗体，再加上技术环节的简单性，所以一直具有不可取代的优势，也广泛应用于科研及诊断。如何得到高亲和性、强特异性、广谱识别性的抗体？实验动物的选择：做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像Epitomics这样的公司用兔子的(有特殊的专利)，还有一些人用大鼠的，当然其它的动物的也有，据不完全统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。但是最主流的还是小鼠和兔子了。虽然兔子能产生高亲和性、强特异性、广谱识别性的抗体,但不存在兔的骨髓瘤样肿瘤).怎么办?1995年，Dr.KatherineKnight在LoyolaUniversityofChicago成功地在在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤(plasmacytoma)。其后几年里，Dr.RobertPytela和Mr.WeiminZhu在UCSF将此技术进行了改进，使之能高产量的生产兔单克隆抗体。兔单克隆抗体(RabMAbs)：新一代单克隆抗体用于科研、诊断和治疗如何获得骨髓瘤样肿瘤?在c-myc/v-abl转基因兔身上成功地获得了兔浆细胞瘤细胞系proto-oncogenes(原癌基因)调控细胞生长和增殖的正常细胞基因。突变后转化成为致癌的癌基因myc转录因子Burkitt淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病Abl-1:非受体酪氨酸激酶慢性髓性白血病美国Epitomics公司成立于2001年9月，与加州大学旧金山分校(UCSF)及芝加哥LOYOLA大学联手开发出新型杂交瘤技术，拥有兔单克隆抗体(RabMabs)技术的全球专利，是国际上唯一一家拥有兔类单抗技术的生物技术公司。2012年3月6日英国上市公司Abcam宣布将以1.7亿美元收购全球唯一兔单株抗体蛋白生物技术公司Epitomics(F-宜佰)Epitomics由于兔脾脏较大，可以进行更多的融合实验，使得高通量筛选融合细胞成为可能。预期后10年数百种治疗性抗体将被开发用于许多疾病的治疗。鼠单克隆抗体与兔单克隆抗体的比较亲和力更高:可以比鼠抗血清识别更多种类的表位识别表位更多:能够识别许多小鼠中不产生免疫的抗原特异性更高、检测灵敏度更高、应用范围更广、背景本底更低浆细胞肿瘤基因工程抗体的制备生物导弹的原理:生物导弹是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物、酶或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。单克隆抗体具有高度专一性，能够识别细胞表面抗原、各种受体、各种体液成分及细胞内和组织内的各种成分，能精确地瞄准和捕获靶细胞，特异性地与靶目标发生反应，因而有“生物导弹”之称。单抗体引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物或使毒素发挥更有效的作用.从而减少药物、毒素、同位素和酶在肿瘤治疗过程中引起严重的副作用,大大提高治疗肿瘤的效果。用鼠单克隆抗体制备的生物导弹有什么问题？杂交瘤是鼠来源的，因此产生的抗体也是鼠源的蛋白，对于人体而言是一种异种蛋白。异种蛋白在人体内可能会引起免疫反应（哮喘、荨麻疹/风疹块，产生抗体等）或被排斥，有时会引起严重的致死性反应，因此自1980年代以来，如何解决生物导弹的这个问题，一直是生物导弹在人体内应用的重要问题。FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4V区抗体基因的改造将鼠源抗体的V区与人源抗体C区基因重组，获得的嵌合体（chimericalantibody),可保留鼠抗体对抗原的高亲和性，又减弱鼠抗原对人的免疫原性，提高治疗性抗体的效果。解决方法鼠单抗恒定区人源化鼠单抗恒定区人源化如何得到亲和力高、特异性强的抗体克隆？通过遗传工程技术改造与生产抗体抗体基因文库将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体（噬菌体）中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库。从这个抗体库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因。优点：一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得亲和力高、特异性强的克隆抗体。主要的抗原抗体反应抗体效价的测定血清：血液凝固析出的淡黄色透明液体，在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原。抗体效价(滴度，titer)：通过血清学方法能显示一定反应的抗血清(或抗体)的最高稀释倍数(或稀释度的倒数)。如终