海参生殖腺的酶水解工艺的研究2

复合蛋白酶水解海参生殖腺工艺的研究*向怡卉苏秀榕**董明敏郑卫星陆福军（宁波大学生命科学与生物工程学院,宁波浙江315211）摘要：结合实际生产和复合蛋白酶的特性，本文研究了复合蛋白酶水解海参生殖腺的工艺及条件。本工艺省去了传统工艺的pH值控制，酶解温度采用程序升温，45℃~65℃。通过单因素和正交实验分析了酶用量、底物浓度及时间对生殖腺水解的影响，确定其最佳水解条件为：底物浓度13%，酶浓度0.4%，时间2.5h。关键词：海参，生殖腺，复合蛋白酶，水解度中图分类号：文献标识码海参，棘皮动物门，海参纲动物的通称，是重要的海洋无脊椎动物。自古以来，海参就是名贵的滋补珍品，具有延缓衰老和防治肿癌的作用[1]。海参生殖腺营养丰富，蛋白含量高，特别雄性生殖性蛋白含量高达55%，比同批海参体壁的蛋白含量(30.15%)高出近25个百分点。海参生殖腺蛋白质的组成种类繁多，包括甘氨酸，谷氨酸，天门冬氨酸，丙氨酸，胱氨酸，精氨酸等18种,包含全部的人体必须氨基酸。近年来多肽越来越受到重视，现代生物学实验已经证明[2]，多肽与蛋白质和氨基酸相比具有更多优点：吸收率好；具有低抗原、促进脂质代谢、降低胆固醇、促进矿物质吸收、降血压、抗氧化等生理功能；有较好的酸、热稳定性、水溶性。目前从海洋生物中通过酶解制备活性肽方面的研究已有报道，并取得一定进展。从海参体壁中制备活性多肽的研究工作也已展开[3]。但是，有关以海参生殖腺为原料制备活性多肽的研究还未有报道。本文主要对复合蛋白酶水解生殖腺最适工艺条件进行研究，同时结合复合蛋白酶本身特性和酶解产品生产的实际需求对传统工艺进行改进，为开发海参生殖腺功能食品提供依据，从而提高海参的综合利用率，丰富功能食品市场。1材料与方法1.1材料海参生殖腺：2004年12月取于大连棒锤岛海参有限公司，活刺参用蒸馏水冲洗后解剖取出内脏，取生殖腺于干净离心管中备用。复合蛋白酶1.0×105U/g，远天酶制剂厂；其他试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1水解工艺：活海参→解剖→取生殖腺→加酶和纯净水→45℃水解→50℃水解→55℃水解→60℃水解→65℃水解→100℃灭酶5min→生殖腺水解液。1.2.2氨基态氮的测定：水合茚三酮法[4]；总氮的测定：凯氏定氮法[5]；水解度的计算：DH（%）=水解的氨基酸太氮/样品中的总氮量×100%。2结果2.1复合蛋白酶水解海参生殖腺的单因素分析影响酶促水解反应的因素很多，诸如反应温度、pH、底物浓度、加酶量、反应时间。即使同一种酶在水解不同底物时，水解的条件也不尽相同，所以首先对酶水解条件进行单因素分析。*浙江省回国人才基金资助项目作者：向怡卉，女，1981.1，硕士研究生，E-mail:[e-mail]。**通讯作者：苏秀榕，研究员，研究方向：食品科学/食品生物技术，E-mail:[e-mail]。2.1.1底物浓度对水解度的影响分别配制底物浓度为8%、10%、12%、14%、16%、18%和20%的海参生殖腺溶液，加酶量为0.5%，45℃、50℃、55℃、60℃和65℃分别水解24min后，得出最佳的底物浓度，结果见下图。01020304050600102030底物浓度（%）DH（%）0.440.460.480.50.520.5400.511.5酶浓度（%）DH（%）图1底物浓度对生殖腺水解度的影响图2酶浓度对生殖腺水解度的影响Fig.1EffectofsubstrateconcentrationonFig.2Effectofenzymeconcentrationondegreeofhydrolysisdegreeofhydrolysis由上图可见，随着底物浓度的降低，水解度逐渐升高，这是因为随着底物浓度的减少，反应体系中的水分会增加，从而降低了反应产物的浓度，减轻了产物对酶促反应的反馈抑制作用。底物浓度为14%时，水解度达到最大，当底物浓度继续下降，相应的反映体系中的水分会增加，酶的浓度减少，水解度开始下降。故底物浓度选14%为宜。2.1.2酶浓度对水解度的影响分别配制酶浓度0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%的复合蛋白酶液，底物浓度为14%，45℃、50℃、55℃、60℃和65℃分别水解24min后，得出最佳的底物浓度（见图2）。随着酶量的增加，水解度增加，酶量为5%后增加的幅度非常缓慢，考虑在实际生产中，酶量的成本以及过量酶对酶解液风味的影响，选择酶浓度为0.3%。2.1.3反应时间对水解度的影响反应时间对生殖腺酶解的影响见图3。从水解的过程看，水解开始2h内，水解度变化快，主要是因为酶活力高，产物的抑制小；随着时间的延长，酶活力逐渐下降，产物的抑制增加，水解度基本上保持稳定。从图3中可知，复合蛋白酶水解海参生殖腺的时间在2h左右为优。00.10.20.30.40.50.6012345时间/hDH（%）图3时间对生殖腺水解度的影响Fig.3Effectoftimeondegreeofhydrolysis2.2复合蛋白酶水解海参生殖腺的正交实验在单因素实验的基础上，制定底物浓度、酶浓度、酶解时间为考察因素，每个因素取3个水平，以水解度为考察指标。表1复合蛋白酶水解海参生殖腺的正交实验Table.1Crosstestofhydrolysisofgonadofseacucumberbycomplexprotease试验号因素A（酶浓度/%）因素B（底物浓度/%）因素C（水解时间/h）水解度/%11(0.3)1(13)1(1.5)39.1921(0.3)2(14)2(2)50.6231(0.3)3(15)3(2.5)45.3742(0.4)1(13)2(2)48.0452(0.4)2(14)3(2.5)54.6462(0.4)3(15)1(1.5)45.573(0.5)1(13)3(2.5)56.983(0.5)2(14)1(1.5)36.3393(0.5)3(15)2(2)41.17K1135.18144.13121.02T=417.76K2148.18141.59139.83K3134.4132.04156.91k145.0648.0440.34k249.3947.2046.61k344.8044.0152.30R4.594.0311.96从上表中极差R值可以看出，各因素对海参生殖腺水解影响程度依次为C＞B＞A，酶解时间影响很大，底物浓度在所考察的范围内影响最小。直观分析可以看出，最佳酶解工艺条件为C3A2B1，即酶解时间为2.5h，酶浓度为0.4%，底物浓度为13%。3讨论3.1复合蛋白酶水解海参生殖腺的适宜底物浓度为14%，酶浓度为0.3%，酶解时间在2h左右，水解度可达50%以上。工艺中结合复合蛋白酶的特点，采用了45℃~65℃程序升温来控制酶解温度，使复合蛋白酶中的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等酶类都能在各自的适宜温度下进行酶解，这样充分发挥了复合蛋白酶的酶解能力。3.2通过正交实验得出海参生殖腺酶解的最佳工艺参数为酶解时间为2.5h，酶浓度为0.4%，底物浓度为13%。比一般酶解工艺少了调节pH值操作，但同时能使水解度在最佳酶解条件下达到60%左右。省去调节pH操作是考虑实际生产的方便性以及酶解产品的安全性。工业化生产中，控制大量的酶解液的pH是很烦琐的的一项操作。省去调节pH，不见仅可以节省大量的人力和物力，而且可以更好的保持酶解液的风味和加强产品的食用安全性。3.3用复合蛋白酶对海参生殖腺进行酶解，工艺简单，能有效的降低了生殖腺胶原蛋白分子量，增加了多肽和氨基酸量，从而提高其营养价值，而且被人体吸收的速度和程度都会有不同程度的增加[3]。海参生殖腺酶解液风味浓厚，营养丰富，可以用于制作口服液、胶囊等功能食品。参考文献[1]廖玉麟.中国动物志（第1卷）[M].北京:科学出版社,1997[2]高福成.食品分离重组工程技术[M].北京:中国轻工业出版社,1998:799-802[3]张或,农绍庄,徐龙权,等.海参蛋白酶解工艺条件的优化.大连轻工业学院学报,2001,20（2）:105-108[4]王文平.植物样品中游离氨基酸总量测定方法的改进.北京农学院学报,1998,13(3):9-12HydrolysisofGonadofSeaCucumberByComplexProteaseXiangYihuiSuXiurongDongMingminZhengWeixingLuFujun(FacltyofLifeScienceandBiotechnology,NingboUniversity,ZhejiangNingbo315211,China)Abstract:Consideringthepracticalproduceandthecharacteristicofcomplexprotease,Processandconditionsofhydrolysisofgonadbycomplexproteasewasstudied.Comparedtotraditionalprocess,controllingpHwassavedinthisprocess.Thetemperatureofhydrolysiswas45℃~65℃.Theeffectsofthemainparametersincludingenzymedosage,substrateconcentrationandhydrolysistimeonhydrolysisreactionwereinvestigated.Onthebasisoforthogonaltest,theoptimumhydrolyticconditionswereasfollows:substrateconcentrationwas13%,enzymeconcentrationwas0.4%andhydrolysistimewas2.5h.Keywords:Seacucumber,Gonad,Complexprotease,Degreeofhydrolysis向怡卉联系方式：通信地址：315211浙江省宁波大学生命学院曹光彪科技楼213向怡卉收电话：[phone]手机：[phone]E-mail:[e-mail]