海洋来源细菌CB101抗肿瘤活性次级代谢产物的初步研究

海洋来源细菌CB101抗肿瘤活性次级代谢产物的初步研究蔡生新1，李德海1，朱天骄1，王凤平2，肖湘2，顾谦群1*（1．教育部海洋药物重点实验室，中国海洋大学医药学院，青岛，266003；2.海洋生物遗传重点实验室，国家海洋局第三海洋研究所，厦门)摘要：目的阐明海洋来源细菌CB101(Aeromonassp.)的化学成分及其抗肿瘤活性。方法对海洋来源细菌CB101(Aeromonassp.)的总提取物采取硅胶柱色谱、凝胶柱色谱及半制备HPLC等分离手段进行活性追踪分离，通过理化性质及波谱学手段进行化学结构鉴定，以SRB及MTT法评价化合物的抗肿瘤活性。结果与结论从海洋来源细菌CB101(Aeromonassp.)的发酵产物中共分离得到9个吲哚衍生物类化合物（1-9），其化学结构分别鉴定为4-[bis-(3-indolyl)methyl]quinoline(1)，2,2-bis(3-indolyl)ethyl-butyrate(2),4-(3-indolyl)hexan-2-one(3)，吲哚(4)，trisindoline(5)，indole-3-ethanol(6)，2,2-di(3-indolyl)-3-indolone(7)，2-[2,2-bis(1H-indol-3-yl)-ethyl]phenylamine(8)，1,1,1-tris(3-indolyl)methane(9),其中化合物1-3为新化合物且具有较弱的抗肿瘤活性。关键词：海洋来源真菌；次级代谢产物；吲哚衍生物；抗肿瘤活性PrimaryInvestigationofAntitumorSecondaryMetabolitesofMarineDerivedBacterium,Aeromonassp.CB101CAISheng-xin1,LIDe-hai1,ZHUTian-jiao1,WANGFeng-ping2,XIAOXiang2,GUQian-qun1*(1.KeyLaboratoryofMarineDrugs,ChineseMinistryofEducation;InstituteofMarineDrugsandFood,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,P.R.China;2.KeyLaboratoryofMarineBiogeneticResources,ThirdInstituteofOceanography,TheStateOceanAdministration,Xiamen,P.R.China)ABSTRACT:OBJECTIVEInvestigationofthesecondarymetabolitesofmarinederivedbacteriumCB101(Aeromonassp.)andevaluatetheirantitumoractivity.METHODSBioactivefractionswereobtainedfromthecrudeextractofCB101(Aeromonassp.)throughabioassay-guidedfractionationandthechemicalconstituentsofthefractionswereinvestigatedandpurifiedbythecombineduseofcolumnchromatographywithsilicagelandSephadexLH-20,thepreparativeHPLC.Theirstructureswereestablishedbyspectroscopicmethods.TheirantitumoractivitieswereevaluatedbySRBandMTTmethods.RESULTSANDCONCLUSIONNineindole-derivedcompounds(1-9)wereisolatedandidentifiedas4-[bis-(3-indolyl)methyl]quinoline(1)，2,2-bis(3-indolyl)ethyl-butyrate(2),4-(3-indolyl)hexan-2-one(3)，indole(4)，trisindoline(5)，indole-3-ethanol(6)，2,2-di(3-indolyl)-3-indolone(7)，2-[2,2-bis(1H-indol-3-yl)-ethyl]phenylamine(8)，1,1,1-tris(3-indolyl)methane(9),respectively.Amongthesecompounds,1-3arenewcompoundsandtheyhaveweakantitumoractivity.Keywords:marinederivedbacterium;secondarymetabolites;indole-derivedcompounds;antitumoractivity海洋微生物多生活在高盐、高压、低营养、低温(特别是深海)和无光照等特殊环境之中,为适应这些生命的极限环境,海洋微生物已发展出独特的代谢方式,也使其产生的海洋天然产物具有种类繁多、结构特异及活性强等特点,这为寻找海洋生物活性物质提供了丰富的源泉。近年来，从海洋来源的微生物中寻找结构新颖、活性独特的生物活性物质日益成为新药发现的重要研究领域。[1-4]本实验室从海洋来源的微生物中追踪新的活性物质的研究中，得到一株分离自厦门海域海水样品的细菌CB101，这株细菌经鉴定为Asromonassp.，它的乙酸乙酯提取物对K562细胞具有很好的抑制活性(52.93%)。本实验从细菌CB101发酵物中分离得到3个新的吲哚衍生物类化合物4-[bis-(3-indolyl)methyl]quinoline(1)，2,2-bis(3-indolyl)ethyl-butyrate(2),4-(3-indolyl)hexan-2-one(3)和6个已知化合物indole(4)，trisindoline(5)，[5]indole-ethanol(6)，[6]2,2-di(3-indolyl)-3-indolone(7)，[7]2-[2,2-bis(1H-indol-3-yl)-ethyl]phenylamine(8)，[8]1,1,1-tris(3-indolyl)methane(9)，[9]利用MTT[10]及SRB[11]法评价了化合物的抗肿瘤活性。1.实验部分1.1仪器和试剂MarinerAPI2TOF型质谱仪；JNM2ECP600型核磁共振仪(日本JEOL公司)；分析用高效液相色谱仪：Waters公司产品(Waters600泵,Waters996二极管阵列检测器,Millennium32工作站,YMC-packODS(A)，4.6×250mm，5μm，1mL/min)；半制备高效液相色谱：日本岛津公司产品（LC-6AD泵，SPD-M20AVP检测器，SCL-10AV型系统控制器，YMC-packODS(A)，10×250mm，5μm，4mL/min）；SephadexLH-20：Pharmacia公司；硅胶H（200～400目）：青岛海洋化工厂产品。LiChroprep®RP-18（25-40m）：Merck公司产品。活性测试采用白血病细胞HL-60和人肺腺癌细胞A-549。磺酰罗丹明B（SRB）为Sigma公司产品。常规提取分离用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等均为工业用化学纯产品，重蒸后使用，液相色谱甲醇为色谱纯。1.2菌种发酵及提取物的获得将细菌CB101接种于含有300mL生产发酵培养液（0.5g蛋白胨，0.1g酵母浸膏，0.1gFePO4，1L陈海水，pH7.2-7.6）的500mL三角瓶中，将盛有100L这种生产发酵液及菌种的三角瓶置于20℃、100rev/min的摇床中发酵3天，获得发酵培养液。将菌株的发酵培养液离心（5000g，30min）,分为上清液和菌丝体.取上清液,直接用100L乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,得乙酸乙酯萃取液,减压浓缩至干,得粗浸膏（15.0g）。1.3化合物的分离取粗浸膏(15.0g)通过硅胶（300-400目）柱层析，利用石油醚/氯仿和氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，得到六个组分。Fr.1通过硅胶柱层析，石油醚：丙酮20:1洗脱，得到化合物4(5g)；Fr.3（150mg）通过硅胶柱层析，石油醚/丙酮梯度洗脱，再经半制备液相色谱(70%CH3OH,4ml/min)纯化得到化合物2(6.7mg,tR15.6min)、化合物3(2.1mg,tR7.6min)和化合物9(15mg,tR12.7min)；Fr.4通过SephadexLH-20柱层析（氯仿/甲醇，1:1）分成五个亚组分，亚组分2再经半制备液相色谱(70%CH3OH,4ml/min)纯化得到化合物1(50mg,tR18.5min)；亚组分3再经半制备液相色谱(70%CH3OH,4ml/min)纯化得到化合物6(4.1mg,tR4.5min)，化合物7(10mg,tR5.8min)和化合物8(10mg,tR9.9min)；Fr.5通过SephadexLH-20柱层析（氯仿/甲醇，1:1），再经半制备液相色谱(70%CH3OH,4ml/min)纯化得到化合物5(7mg,tR6.4min)。化合物的结构见Fig.1。1.4化合物活性测试细胞增殖抑制活性测试采用四氮唑盐(microculturetetrozolium,MTT)还原法和磺酰罗丹明B(sulforhodamineB,SRB)蛋白染色法。2.实验结果与讨论2.1新化合物结构解析化合物1:白色无定形粉末，高分辨质谱:m/z374.1654[M+H]+(calcd.374.1657)给出分子式为C26H19N3，通过分子式可以看出化合物1中具有19个不饱和度。通过对氢谱和碳谱信号δ8.05(2H,brs),7.37(4H,brd,J=8.2Hz),7.19(2H,ddd,J=8.2,7.3,1.0Hz),7.02(2H,ddd,J=8.2,7.3,0.9Hz),6.56(2H,brd,J=1.9Hz)和δ136.7(s),126.6(s),124.3(d)，124.3(d),122.2(d),119.4(d),117.5(s),111.2(d)以及HMQC和1H-1HCOSY的分析，可以得出在化合物1分子中含有两个3位取代的吲哚环片断；通过同样的方法可以得出在化合物1分子中含有一个4位取代的喹啉环片断(1HNMR:δ8.74(1H,d,J=4.6Hz),8.15(2H,dd,J=8.7,2.8Hz),7.66(1H,ddd,=8.7,6.8,1.4Hz),7.43(1H,ddd,J=8.7,6.9,1.4Hz),7.15(1H,d,J=4.6Hz);13CNMR:δ150.3(d),149.7(s),148.3(s)129.9(d),128.9(d),127.3(s),126.5(d),124.2(d),120.9(d))。在HMBC谱上通过H-1和C-2',C-3',C-3a',C-2'',C-3'',C-3a'',C-3''',C-4''',C-4a'''之间的相关可以将两个吲哚片断及喹啉片断连接在一起。通过以上分析确定化合物1的结构为4-[bis(3-indolyl)methyl]quinoline。化合物2:白色无定形粉末，高分辨质谱:m/z369.1577[M+Na]+(calcd.369.1579)给出分子式为C22H22N2O2，通过分子式可以看出化合物2中具有13个不饱和度。同化合物1，化合物2的氢谱和碳谱分别在δ7.98(2H,brs),7.62(2H,brd,J=7.8Hz),7.35(2H,brd,J=8.3Hz),7.18(2H,ddd,J=8.3,6.8,0.9Hz),7.06(2H,ddd,J=7.8,7.3,0.9Hz),6.