文献翻译-蛋白质

THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRYVol.262,No.20,IssueofJuly15,pp.9902-99071987©1987byTheAmericanSocietyofBiologicalChemists,Inc.PrintedinUSA氧自由基对蛋白质的损伤和降解Ⅱ氨基酸修饰（发表日期：1986.12.30）KelvinJ.A.Davies,MartaE.DelsignoreS,andSharonW.LinFromtheInstituteforToxicologyandtheDepartmentofBiochemistry,TheUniversityofSouthernCalifornia,LosAngeles,California90033蛋白质的羟基自由基羟基与超氧阴离子自由基·OH+02-(+02)相结合造成重大的结构改造。这种修饰的蛋白质可以发生自发性的断裂形成碎片或可以表现出在蛋白水解的易感性大幅增加。在目前的研究中，我们报告具有代表性的蛋白牛血清白蛋白（BSA）在初级结构的基础上的结构修饰。BSA所有氨基酸中都容易被·OH和·OH+02-(+02)修改，尽管色氨酸，酪氨酸，组氨酸和半胱氨酸特别敏感。在自由基/BSA的摩尔比（nmol自由基/nmolBSA）为10时，我们观察到平均9-10%的氨基酸被的破坏；而在比率为100时，平均损失为45%。随之减少的色氨酸荧光为氨基酸损失提供了一个有用的指标，并呈现明显的·OH或与·OH+02-(+02)剂量依赖性。在进行·OH处理后同时观察到了双酚二聚酪氨酸的线性产生。相反，·OH+02-(+02)仅仅导致有限的二聚酪氨酸生产速度，且其很早进入平台期。对各种化学清除剂（叔丁醇的研究，异丙醇，甘露醇，尿酸盐）和气体（N20，02，N2，空气）的研究表明，·OH是造成所有氨基酸修饰的原始基团，但02-和O2可以进一步改造·OH的反应产物。因此，02-/02可以增强许多氨基酸（如色氨酸）·OH依赖的破坏，同时通过与酪氨（苯氧基）自由基反应来抑制二聚酪氨酸的产生。当单独暴露在02-(+02)时，没有氨基酸的损失或二聚酪氨酸产生。由于·OH单独作用或者·OH+02-(+02)进一步影响产生的氨基酸的修饰可以导致BSA的整体电荷量的改变。在3.7-6.2的pH范围内，一些16个新的等电点聚集带被·OH诱导产生，约8个新的带被·OH+02-(+02)诱导产生。一级结构的改变提供了一个去理解氧化修饰和增加蛋白水解敏感性之间的联系的要点。在前面的文章(1)中指出,氧自由基能够氧化修饰蛋白质并通过细胞内蛋白水解系统增加其降解。越来越多的文献表明,氧化改性和蛋白水解作用可能密切相关(1-19)。然而，我们对氧化改性蛋白质被识别和降解的机理知道的很少。要了解细胞内的蛋白水解系统识别和降解氧化改性的蛋白质,首先需要仔细描述这种修饰作用。先前关于蛋白质的自由基损伤的研究表明，各种各样的反应都可能发生(20-28)。在前面的文章(1),其中的一些反应虽然到目前为止还没有建立因果关系，却被发现与蛋白水解敏感性增加一致。为了改善我们对潜在的蛋白水解作用的“信号”的理解,我们现在执行蛋白质一级结构被氧自由基修改的剂量反应研究。我们和其他研究人员观察到（1—19），改变原结构无疑是在蛋白酶解基础上蛋白一级结构的改变。在随后的论文（2）中，我们研究了蛋白质二级和三级结构的修饰，并且修饰和蛋白水解的敏感性之间的联系也在本系列的第四篇文章探讨了（3）。由于各种原因我们决定把努力集中在对牛血清白蛋白（BSA）1的研究上。在前面的论文（1）中，BSA被证明是可以被氧自由基改性修饰的，表现出要么是易碎性，要么是增强的蛋白水解的敏感性。BSA的出现对先前研究的17蛋白（1）是一个很好的模型，它还增加了优势：它摆脱了辅基和其它一些复杂的因素。BSA的一级，二级，和三级结构在文献（29，30）已得到很好的特征化，并且有BSA被氧自由基修饰的几种报告可供比较（31-35）。最后，BSA是一类主要的动物蛋白，并且其纯化形式可以被迅速利用。在之前的报告（1）我们已经把BSA暴露在羟自由基（·OH），超氧阴离子（02-），以及·OH+02-(+02)中，这可以模仿生物的曝光条件。研究进程本文报道的实验材料是一种来自Sigma(A0281)的游离球蛋白BSA（M，66，200），同时伴有脂肪酸。在其他白蛋白制剂的初步实验中（未示出），Sigma产品A4378和MilesScientific(Naperville,IL)products81-001-2,81-028-a2n,d81-018-1g有非常相似的结果。氧自由基对BSA的氧化----BSA被暴露于使用60Co辐射的氧自由基·OH，02或·OH+02。单独曝光在·OH，用100%的N2O照射来实现的，单独曝光在02用100%02照射，并且需要0.01M甲酸钠。暴露于·OH+02时，被100%02照射。辐射过程是在双蒸馏水和去离子水（无缓冲）中与5.0PmBSA溶解（0.33毫克蛋白质/毫升）进行。这些过程在前面的文章（1）中有详细说明。剂量率为634±5rad/min，是由Fricke和Hart测量的（36）。为了实现1-120nmol自由基/nmol（摩尔）BSA在氧自由基暴露（0.8-100千拉德的总剂量），辐射时间是变化的。氨基酸分析----BSA在分析之前与6NHCl下水解20h（110℃）。用Beckman6300和DurrumD-500氨基酸分析仪定量分析天然氨基酸。计算两种仪器结果的平均值。每次运行前与所有氨基酸混合标准和内部标准0-thienylalanine校准（10纳米）。方法的检出限约为每个氨基酸0.2nm。荧光检测----荧光测量色氨酸的破坏，二聚酪氨酸产生，与荧光胺反应，都通过鲍曼荧光测量技术检测。正如在前面的文章所述（1），信号强度校准与0.1毫克/毫升硫酸奎宁硫酸溶液中的相反。要测定色氨酸的损失及生产二聚酪氨酸的量，1.6mlBSA（0.53mg蛋白）中加入0.4毫升0.1MHEPES缓冲液（pH7.0）。以340-350nm荧光发射（激发波长为280nm）来测量色氨酸含量（37）。荧光损失是由在游离色氨酸受到-OH氧化时的色氨酸氧化直接得出。尽管荧光测量对蛋白质来说是更复杂的，然而，我们没有尝试转换到色氨酸残基的荧光强度。与真实的酪胺及二聚酪氨酸比较（38），二聚酪氨酸含量与在325nm的激发和410-420nm的发射波长是的量相同。通过与荧光胺反应来测定游离氨基酸反应（39）。10微升的BSA（3.3微克蛋白质）被添加到2.49毫升的0.05M磷酸钠缓冲液（pH8）。旋转搅拌，加入含0.5毫升荧光胺（0.4mg/ml的丙酮溶液）。在390nm波长激发，475nm波长发射，与标准荧光比较测量所产生的游离氨基酸。电荷改变--等电聚焦凝胶被用于检测主要结构影响总电荷的改变。超薄等电聚焦凝胶（0.2毫米）用GelBond背膜（40，41）。两性电解质（Bio-Rad）被选择用于有效pH值范围为3.7-6.2时。结果氨基酸的一般性损失，是单独与·OH反应或·OH+02-(+02)反应是的损失，与大多数氨基酸产生类似（剂量依赖性）的损失（表I）。此规则的例外是半胱氨酸似乎在暴露于-OH增加，曝光与·OH+02-(+02)是减少。虽然公布的游离氨基酸的反应速率常数（42）有一定的预测价值，但是很明显所有的氨基酸都必须考虑在内。据推测，一级，二级，和一个蛋白的三级结构在很大程度上影响每个氨基酸的活性。在table1中报告过的那样，氨基酸损失会对蛋白质的结构和功能产生极大的影响。对-OH清除剂甘露醇的研究表明，所有氨基酸修饰的（除了一些半胱氨酸相关）都是由·OH发起的。在table1报告过，在单独·OH曝光或·OH+02-(+O2)曝光时加入1mM甘露醇，90%氨基酸修饰被抑制。所有氨基酸中除了半胱氨酸，观察到这种抑制作用的基/BSA摩尔比都是10/100，而半胱氨酸中保护了60-75%。提高甘露醇的浓度为10或100毫米的影响不大。由于甘露醇不与O2-反应，这些数据表明O2-对半胱胺酸以外的所有氨基酸不产生活性。O2-单独反应时，除了半胱氨酸外的氨基酸没有产生可检测的变化，在O2-／BSA的摩尔比为120（数据未显示）时，半胱氨酸氨基酸增加了约3倍。有趣的是，因为02-没有显著破坏氨基酸，·OH和·OH+02-(+02)也有类似的效果（表I）。因为溶剂化电子在氧气条件下易被02-修饰，暴露于·OH+02-(+02)相比于单独曝光在·OH中只有一半变化。02歧化作用产生过氧化氢,但在单独的实验中，没有氨基酸的改变是由高达150的BSA/过氧化氢摩尔比中的过氧化氢单独产生的，除非添加过渡金属（数据未显示）。色氨酸的损失---虽然BSA包含几个酪氨酸和苯丙氨酸残基以及只有2个色氨酸，观察到超过99%的荧光在340-350nm发射（280nm激发）是色氨酸（37,43）。BSA单独曝光于·OH或·OH+02-(+O2)导致原生色氨酸荧光迅速下降（图1）。由色氨酸的破坏曲线的形状表明，修饰的色氨酸可与天然色氨酸残基竞争氧自由基。02-单独曝光没有产生显著的色氨酸损失（图一），与上文所述其他氨基酸的结果一致。叔丁醇是一种有效的·OH清除剂，但不与H+反应（44-46）：H+表示约8%的辐产量在100%N2O下照射。当一氧化二氮在1.0Mt-丁醇下辐照，观察到色氨酸损失小（图2）。随着辐射增强，色氨酸荧光慢慢下降，这可能因为与叔丁醇混合自由基反应。在100%氮辐射下，异丙醇清理·OH和H+，唯一留下e-aq未反应(44-46）。100%N2再加上1.0M异丙醇（图2）的组合产生与N20加叔丁基酒精有非常相似的结果，这表明色氨酸破坏很大程度上是由于·OH。甘露醇（42）和尿酸(47-49）常被用作在实验室中的·OH的清除剂。尿酸也可能是一种重要（水溶性）生物抗氧化剂（47-49）。甘露醇和尿酸盐的保护作用防止色氨酸丢失（图3）。二聚酪氨酸生产----在所有测试剂量下，·OH诱导二聚酪氨酸的线性产生（图4）。与此相反的是，暴露于·OH+02-(+02)诱导一个限制更多的反应，并更早达到稳态。很少或没有二酪氨酸生产时单独暴露于02-。异丙醇强烈抑制二酪氨酸产生（图4）。这些结果与·OH启动二酪氨酸生产的概念是一致的。由于干扰荧光产品的产生，与叔丁醇的混合无法进行有意义的抑制实验。甘露醇是暴露于·OH或·OH+02-+02生产二酪氨酸的有效抑制剂（图5）。尿酸对单独·OH暴露生产二聚酪氨酸给了很少或没有保护。然而当暴露于·OH+02-+02是，尿酸是部分抑制产生二聚酪氨酸（图5）。我们的结果与早先的报告是一致的（38，50，51），氢与·OH产生酪氨酸（苯氧基）自由基。酪氨酰自由基可以与其他的酪氨酰自由基或酪氨酸分子反应形成几种稳定的双酚化合物的。2-2′-双酚，二聚酪氨酸是最主要的产品（38）。02-与O2可能竞争与酪氨酰自由基反应，从而解释了其对生产二聚酪氨酸的抑制作用（38,52）。尿酸无法作为二酪氨酸生产的高效抑制剂，这可能与相关观测数据中，蛋白质可以作为“电子线”与酪氨酸作为“电子汇”有关（23，53）。因此，一种体相抗氧化剂可能需要使用浓度相对较高，前提是它是有效（尿酸盐溶解度有限）抗氧化剂。各种缓冲剂的影响---尽管我们研究了牛血清白蛋白在双蒸馏水和去离子水中的情况，其他的研究人员也经常用缓冲液来稳定他们正在研究的蛋白质。几种通常用于蛋白质研究的缓冲液在BSA修饰效果明显，表现为色氨酸损伤和二聚酪氨酸生产（表1）。Tris和HEPES对色氨酸的损失和二聚酪氨酸生产提供显着的保护。碳酸钙加强色氨酸的损失，并大大增加410-420nm荧光。这种增加可能反映了生产的荧光碳酸产品，而不是真正的二聚酪氨酸。磷酸盐缓冲液提供更类似于那些用水得到的结果。这些数据表明Tris、HEPES和复合碳酸盐不应用于蛋白自由基改性的研究。磷酸盐缓