分子生物学基础试验

分子生物学基础实验指导老师：肖靓分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，分子生物学实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。实验要求上课时间与纪律：严格遵守老师的安排。实验室内禁止饮食、勿高声谈话、随意走动。课前预习、课中认真操作、课后的实验报告。妥善保管好每组的实验器具。实验操作要求人人动手。值日制度：每天五位同学。一、质粒DNA小量制备的实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖。载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增。载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入。载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1－120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内复制的两种类型严密控制型（stringentcontrol）：质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。松弛控制型（relaxedcontrol）：质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColEⅠ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的质粒。分离质粒DNA的三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（opencircularDNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、实验目的与内容目的：学会使用碱裂解法提取质粒DNA。内容：细菌培养及菌体的收获、碱裂解法提取质粒DNA。三、实验材料和试剂材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。仪器：台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。高压蒸汽灭菌锅超净工作台台式高速离心机恒温摇床恒温培养箱试剂1.溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA。灭菌后存放。临用前加溶菌酶4mg/mL。2.溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)，现配现用。3.溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。4.酚/氯仿液(V/v＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24：1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。5.pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。6.无水乙醇7.70％乙醇8.LB培养基LB培养基的配制每升含有胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，NaCl10g,琼脂糖或琼脂（固体培养基时用）15g,用NaOH调pH至7.5。微量移液器（pipetman）的使用微量移液器是连续可调的，计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计，读数由三位拨号数字组成，在移液容量范围内能连续调节，从上（最大数）到下（最小数）读取。微量移液器的构造微量移液器的操作1）将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；2）垂直握持微量移液器，将吸嘴浸入液样面下几毫米，千万别将吸嘴直接插到液体底部；3）缓慢，平稳的松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少；4）等一秒钟后将吸嘴提离液面；5）平稳得把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体；6）提起微量移液器，让吸嘴在容器壁擦过；7）然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。微量移液器的操作注意：1）未装吸嘴（tip）的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体；2）一定要在允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏；3）不要横放带有残余液体吸嘴的移液器；4）不要用大量程的移液器移取小体积样品。离心机的使用应注意保持离心管放置位置的对称以及离心管中样品的平衡，离心管放进离心机前应先用卫生纸擦干，此外应注意离心机在离心机内的放置方向。电子天平的使用注意在天平的最大称量范围内使用。天平应放在无振动、无空气对流处，使用前须先调节水平泡至中央位置。使用后应保持仪器的洁净。微波炉的使用微波炉内不可使用金属容器以及空载。四、操作步骤(一)培养细菌将带有质粒pBR322的大肠杆菌接种在含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。注意：添加Amp时，须待LB培养基冷却到50℃左右方可加入。(二)从菌落中快速提取制备质粒DNA1.取1.4mL菌液置于1.5mLEp管中，转速10000r/min，离心3min。2.弃上清，加入150μLGET缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。3.加入200μL新配制的0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。4加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。5.4℃，10000r/min，离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mLEp离心管中，如上清液浑浊则需重新离心一次。6.于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000r离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mLEp管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。7.向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。8.小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。9.用0.5mL70％乙醇洗涤沉淀一次，除尽乙醇，室温自然干燥，备用。10.用25uL含无DNA酶的胰RNA酶(20ug／mL)的TE重新溶解DNA，贮存于-20℃备用，可长期保存。五、注意事项1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。6．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。六、问题和思考1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？2．质粒的基本性质有哪些？3．碱裂解法提取质粒DNA中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么？4．抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？5．如何提高质粒DNA的产量？七、实验报告1.原理：简明扼要地概括2.材料与方法：包括实验材料、试剂以及用具(厂家)。不要照抄，但要写得明白，自己或他人日后能够重复。3.结果：实验记录及数据处理4.讨论：分析---数据；解析---现象、问题，定性地针对实验下结论。(1)结果的准确性(2)误差（人为、仪器）(3)问题的提出(4)异常结果分析(5)对实验设计的认识、体会和建议，提出改进的意见。最后：附上个人实验结果与总结八、实验考核到课率及实验操作（实验仪器的维护）50分实验的结果15分实验报告20分公共实验的参与10分实验结束后的口试5分