农杆菌感受态细胞的制备

农杆菌感受态细胞的制备（以GV3101菌株为例）：1.在新铺制的加有20mg/LGen（庆大霉素）、50mg/LRif的YEB固体培养基上，用接种环或灭菌牙签“平板划线法”通过分区划线稀释分离得到农杆菌GV3101菌株的单克隆菌落。2.挑选一个单克隆菌落，接种到5mL新鲜的加有20mg/LGen、50mg/LRif的YEB液体培养基中，置摇床上28℃振荡培养过夜。3.将过夜摇浓的GV3101菌液按1:100比例接种到50mL新鲜YEB液体培养基中，置28℃摇床，200r/min振荡培养至OD600为0.5左右，将菌液转移至50mL离心管，冰浴30min。4.集菌：将菌液置于4℃预冷的离心机中离心，4,000r/min，10min。5.重悬：弃上清，加入10mL预冷的0.15MNaCl溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，4,000r/min，4℃离心10min。6.重悬：弃上清，加入1mL预冷的20mMCaC12溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，分装至预冷的1.5mL无菌离心管中，液氮速冻后，-80℃保存备用。农杆菌感受态细胞的转化（冻融法）：将农杆菌感受态细胞从-80℃取出后置冰上自然解冻，在超净台中用无菌枪头吸取2μL质粒加入到感受态细胞中，轻轻吹打混匀后于冰上静置30min，再经液氮速冻2min，37℃水浴热激5min，在超净台内加入900μLYEB液体培养基，置28℃摇床100r/min慢速震荡复苏培养4-6h。复苏后的菌液离心，弃去约800灿上清，余下上清将菌体重悬起，均匀涂布到抗性筛选YEB固体培养基上，培养平板倒置于280C恒温培养箱内避光培养36—48h。菌落PCR初步鉴定阳性克隆：用灭菌牙签蘸一点菌落作为模板材料将其溶解在PCR反应体系中，PCR程序中的预变性时间相应延长，使细菌细胞壁裂解释放出核质。通过比较电泳条带的大小，初步确定是否为阳性克隆。