限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用

PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓限制性核酸内切酶切割原理、方法、结果分析及应用课堂内容回顾：1、定义：1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。2、分类：（根据酶的基因、蛋白质结果、依赖的辅助因子及DNA裂解的特异性，将限制性内切酶分为三种类型）Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNA。Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别和切割DNA双链，所以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测{Ⅰ型酶：具有DNA修饰的作用在非特异位点处切割DNA。Ⅱ型酶：是最重要的工具酶‘能在DNA分子内部的特异位点识别和切割DNA双链，所以通常所说的限制性内切酶就指这一类酶。Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制与修饰活性，其切割位点很难预测。3、命名：规则：第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名第二、三个字母（小写）：该细胞的种名第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中不同限制性内切酶的编号例如：EcoRⅠ、HindⅢ等等限制性核酸内切酶切割原理1、Ⅰ类和Ⅲ类酶：在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。2、Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）几种限制性内切酶的切割位点例如：3、同工异源酶：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。如：BamHⅠ和BstⅠ，XhoⅠ和PaeR7等可以相互代替使用。4、同尾酶：识别序列不同，但产生相同末端的限制性内切酶。如：BamHⅠ和Sau3AⅠ等由此产生的DNA片段可借黏性末端相互连接，操作是具有更大的灵活性。通过使用(15种)限制性内切酶酶切重组质粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶切图谱分析的方法o方法：1.质粒的构建采用聚合酶链反应chainreaction，PCR)方法扩增出MLCKcDNA片段，插入质粒pBKrsv中，构建成pBKrsv-MLCK重组质粒2.酶切、构建、片段的纯化和连接按Maniatis等方法进行。3.重组质粒的转化转化采用“热休克”法。4.重组质粒的提取挑取阳性克隆，在LB培养基中培养，采用碱裂解法提取重组质粒。5.定量取5μLDNA溶液用4.5μl去离子水稀释，用紫外分光光度计比色，读取AZ60和AZ80吸光度值，计算出AZ60/AZ80比值，按下列公式计算质粒DNA浓度,本实验中质粒DNA浓度为1.0g/L。质粒DNA浓度(g/L)=AZ60X稀释度/Z0=AZ60X56.重组质粒的限制性核酸内切酶酶切取0.5ml离心管15只，分别加入质粒2μl(2μg)，依次加入限制性内切酶AccI、ApalI、AvaH、BglI、BglH、NcoI、OxanI、PuvH、PpUMI、SalI、SspI、SstI、XbaI、Hind皿、EcoRI各0.5微升及相应的NEBuffer2μL、BSAμL、去离子水13.5μL、混匀、点动离心，37℃水浴孵育2小时。7、配置1.5％的琼脂糖凝胶称取琼脂糖0.6g,加入1XTAE缓冲液40ml置微波炉中,中火120s，熔化后冷却至60℃，加入3μL10g/l溴化乙锭，混匀，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入电泳槽中。电泳槽中加入1×TAE缓冲液。8、电泳取酶切产物8μl与DNA上样缓冲液2μl混匀，进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可观察到橘红色DNA条带，结果如图Loremipsumdolorsitamet,consecteturadipisicingelit.结果重组质粒pBKrsv-MLCK全长7378bp，通过DNAstar软件分析获得各酶酶切位点的信息，选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点，计算酶切后片段大小的理论值经各种限制性内切酶酶切后，获得不同大小的片段，经电泳分析与理论设计完全一致。结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向(orientation)l在选择限制性内切酶时,应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点,这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要。在进行限制性内切酶实验时首先应进行DNA的定量，1U酶的限制性内切酶活性指在一定时间内(60min)~适当温度下和建议使用的缓冲液中,在50μl反应体系中,将1μg底物DNA完全消化所需要的酶量l单位活性依所用底物的不同而不同,使用其他底物时,应根据情况确定所用酶量l根据本实验室的经验,1μg底物DNA加入5U的限制性内切酶在2h时间内可以酶切完全，通常延长消化。实验中可能出现的问题及其讨论解决方法1.标准底物检测酶活性2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3.检查反应系统是否最佳4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株5.换用不同切割非甲基化位点的同类酶消化DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增6.将DNA底物与λDNA混匀进行切割验证7.换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证一.如果DNA完全没有被内切酶切割？1.内切酶失活2.DNA不纯，含有SDS，酚，EDAT等内切酶抑制因子3.条件不适（试剂、温度）4.DNA酶切位点上的碱基被甲基化5.DNA酶切位点没有甲基化(如Dpn1)6.DNA位点上存在其它修饰7.DNA不存在该酶识别顺序解决方法二.如果DNA切割不完全？1.内切酶活性下降2.内切酶稀释方法不正确3.DNA不纯，反应条件不佳4.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰5.部分DNA溶液粘在管壁上6.内切酶溶液粘度大，取样不准7.酶切后DNA粘性末端退火8.由于反应溶液、温度使内切酶变性9.过度稀释使酶活性降低10.反应条件不适11.识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序1.用5-10倍量过量消化2.用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3.同上4.同上5.反应前离心数秒6.将内切酶稀释，增大取样体积7.电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8.使用标准反应缓冲液及温度9.适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10.使用最佳反应体系11.加大酶量5-10倍1.用λDNA作底物检查酶切结果2.电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段三.如果DNA片段数目多于理论值？1.其它内切酶污染2.底物中含其它DNA杂质解决方法限制性核酸内切酶的应用用于DNA基因组物理图谱的组建基因的定位和基因分离DNA分子碱基序列分析比较相关的DNA分子和遗传工程将水稻叶绿体的DNA，用EcoR1限制性核酸内切酶消化后，放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝胶中做电泳分离。从LMP中分离出分子大小为1.8-2.5kb之间的DNA片段，再与同样经过EcoR1限制性核制性内切酶切割并用碱性磷酸酶做了脱磷酸化处理的pBR322质粒连接，然后将混合物转移到大肠杆菌5346菌株，培养在氨苄青霉素选择板上，形成Ampr转化子菌落群体。这样就构成了由EcoR限制性核酸内切酶切割的水稻DNA基因组库。用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的psbADNA探针做菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体。从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒DNA，经进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因psbA的序列。应用一应用二利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子，操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了