沙棘多糖的提取

首先用蒸馏水清洗干叶，以洗掉尘土、浮渣，去掉粗梗，剪细。适量石油醚反复脱脂，滤渣自然挥干，再用常温水浸泡一次，80℃热水浸泡两次，以提取水溶性物质，然后合并所有水提液，采用旋转蒸发仪在适宜条件（t＝50℃，抽真空0.09Mpa）下浓缩溶液至适宜体积，sevage法反复操作去蛋白，最后用95％的乙醇使溶液达到不同的浓度而沉淀出多糖，优选出沉淀沙棘多糖的最优醇浓度。0－5℃冰箱中放置48小时后，过滤时用无水乙醇，丙酮洗数次，真空抽干。粗产品重新溶解于适量水中，然后通过大孔树脂进行纯化，蒸馏水洗脱，洗脱液在PH值为8时，用20％的H2O2，50℃以下保温2h脱色，以保证产品的颜色，最后用95％的乙醇使溶液醇浓度达到80％以析出多糖，重复上面的析糖操作，最后保存产品于干燥处。用D（＋）—葡萄糖作标准，苯酚－硫酸法制备标准曲线，求出线性回归方程，从而得到粗多糖的含量，由此也可以算出沙棘叶中多糖的百分含量。然后进行TLC法初步定性确定多糖成分，再进行核磁共振定性分析，即可检验其准确成分沙棘（HippohaerhamnoidesL.），胡颓子科植物，分布于欧亚大陆的温带、寒温带及亚热带髙三区。我国的东北、华北、西北和西南等地区是沙棘属植物的主要分布区。由于沙棘属植物具有极强的生态适应性并富含多种营养成分和生物活性物质，已引起各国工作者的广泛重视。沙棘是一种富含生物活性物质的天然植物，目前已发现的生化成分达190多种。我国是最早利用沙棘的国家，在成书公元八世纪的藏医学典籍《四部医典》中就详细地记载了它的药性。但是最早对沙棘进行系统科学研究的是前苏联学者，我国对沙棘的研究始于1985年，并将沙棘列为国家科技攻关项目加以重点研究，如今已有专刊――《沙棘》（由国家水利部主办）。在前苏联，科学家开发利用沙棘由食用转向以生化研究为基础的医用研究，并将沙棘果油和沙棘汁及其制品运用于宇航食品，作为特殊的“日餐必需添加剂”[1]。而在沙棘的开发中，黄酮类化合物一直是国内外学者较为关注的一类物质。PeterC.H.Hollman等人就黄酮类物质的分析及其重要作用写了一篇综述[2]。前苏联学者发现沙棘黄酮具有扼制动脉粥样硬化，降低血液中胆固醇等作用。国内王家良王秉文等对沙棘的研究较多，其研究表明：沙棘黄酮能显著增加心脏的收缩和舒张功能有明显的抗心肌缺血作用及抗心律失常作用[3－4]。沙棘有很好的生态作用。是我国“三北”防护林的主要树种之一，对于保持和改善那些地区的水土保持和生态环境起了重要作用[5]。沙棘叶又是优良的饲料或饲料添加剂，沙棘具有更高的蛋白质和脂肪含量以及更好的适口性[6]，毒理学实验表明，沙棘叶和沙棘残渣均具无毒物质。沙棘的嫩叶还可以炒制茶叶、提取SOD用于化妆品等广泛用途。综上所述，沙棘叶中的有效成分丰富，开发沙棘叶大有可为。目前对于沙棘果汁、果油的开发研究利用已经比较成熟，但是其综合利用技术不够成熟，沙棘叶的研究也不是很多，尤其是沙棘叶中多糖的研究，国内外对此有关的研究还没有见于发表，其生理活性目前也尚未证实，但是从相关报道来看，植物多糖主要有以下生物活性[7-14]：免疫调节、抗癌防癌及抗遗传损伤、抗辐射及促进骨髓造血机能、降血糖、降血脂（枸杞多糖）及抗动脉粥样硬化（如云芝多糖）、抗氧化及抗衰老、保肝以及其他抗凝血、抗胃溃疡、抗炎、抗微生物、镇静、抗惊厥、止喘降血压作用。而从沙棘叶的多种功用可以估计它的多糖也应具有多种活性，而且在提取黄酮的工艺中可以同时充分提取多糖，大大增加沙棘叶的综合利用价值，创造高价值产品，可对当地人民找到一条可行的脱贫致富途径。这样又可调动当地农民的积极性，大力种植沙棘对加快黄土高原综合治理，促进生态环境的改变，防止沙漠化等具有重大的社会生态价值。对绿化荒漠更是形成良性循环。因此，本文对沙棘叶中多糖的探索研究很有必要，具有开创性意义。因此本实验首次研究沙棘叶中多糖的提取分离，借鉴其他植物多糖成分的提取方法，再考虑沙棘叶的自身特点，改进传统分离多糖的方法，采用AB－8大孔树脂分离纯化各种多糖，无污染，效率高，节省成本，优选出沙棘叶多糖提取分离的最优工艺。测定其中粗多糖的百分含量，然后进行TLC法初步定性确定多糖成分，再进行核磁共振定性分析[15-18]，即可检验其准确成分。根据其具体成分，便可以知道沙棘叶中多糖的理论药理作用。2．实验部分2.1原料及仪器2.1.1原料沙棘叶（内蒙）；大孔树脂（AB-8）；石油醚（60－90℃）；工业酒精（95％）；浓硫酸(95.5%)；苯酚(AR)；无水乙醇（AR）；丙酮（AR）；乙醚(AR)；D(+)-葡萄糖(AR)；PH试纸；2.1.2仪器752紫外可见光分光光度计；RE-52A旋转蒸发仪；医用离心机(4000r/min)；新飞电冰箱；SH2-D（Ⅲ）循环水式真空泵；2.2实验方法2.2.1原料准备：（1）试剂的准备20％的H2O2：166.7ml30％的H2O2稀释定容到250ml；0.05M的NaOH溶液：2gNaOH于1000ml容量瓶中定容；苯酚（5％）[19]：30g苯酚加水70ml使之溶解得到30％的苯酚，置于冰箱中避光保存。临用时振荡混匀取4ml稀释至20ml，即为5％浓度；树脂的预处理及再生[20]：AB8树脂用丙酮浸泡数天，湿法装柱，再用丙酮洗至流出液与水混合不产生浑浊，再用大量水洗，水浸泡备用。0.05M的NaOH溶液洗至无色，水洗至中性，95％的乙醇洗至无色，水洗。（2）沙棘叶的预处理将干沙棘叶用蒸馏水洗去尘土，时间要迅速，50℃烘箱中烘干。筛掉较大的梗和粗枝，将叶子轻轻于研钵中压碎，不要太碎，放于干燥处备用。2.2.2沙棘叶粗多糖的提取（1）脱脂将100g预处理过的沙棘叶浸泡于1200ml石油醚中8小时，再换一次石油醚，以石油醚浸过叶子为准。6小时后倒出石油醚，自然挥干石油醚。（2）提取取脱脂过的叶子40g，分两份，依次用蒸馏水250ml（常温）、200ml（80℃）、150ml（80℃）均浸泡1小时。合并所有浸提液，共1200ml，旋转蒸发浓缩至400ml（t＝50℃，抽真空0.09Mpa）。（3）脱蛋白脱蛋白有多种方法：三氯乙酸法，sevage法，等等，基于试验条件，采用sevage法[21]较为适宜。1/5浓缩液体积的氯仿，1/25浓缩液体积的正丁醇，剧烈振荡20分钟，然后搅拌5小时，分液漏斗静止分层1小时，分离掉有机溶剂和沉淀，再反复一次，基本可除尽蛋白质。（4）醇析除蛋白后的溶液浓缩至50ml，加入95％的乙醇使其浓度分别达到50％、60％、70％、80％、85％。放在0－5℃冰箱中48小时。取出后抽滤，分别用无水乙醇，丙酮洗数次，真空抽干,得到粗产品。2.2.3多糖的纯化（1）过柱将得到的粗产品重新完全溶解于适量水中，将预处理过的AB－8树脂湿法装柱，控制流速3ml/min，用水洗脱，控制流速6ml/min，洗至洗脱液递加95％的乙醇无沉淀。（2）脱色浓缩液体至50ml，加入40ml0.05M的NaOH溶液，调剂PH值至8，再滴加20％的H2O2，50℃以下保温2h除尽未反应完的H2O2。（3）重析将脱完色的溶液浓缩至50ml，加入95％的乙醇使其浓度达到80％，使其沉淀完全，放在0－5℃冰箱中48小时，取出后抽滤，分别用无水乙醇，丙酮，乙醚洗三次，真空抽干。得到较纯产品。干燥处保存。2.2.4总多糖含量的测定标准曲线的制备[22]及样品含量的测定采用用D（＋）—葡萄糖作标准，苯酚－硫酸法制备标准曲线。精密称取D（＋）—葡萄糖0.02g，定容100ml，分别取0，0.4，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8。稀释至5ml，加入1.0ml苯酚（5％），摇匀静止，立即加入5.0ml浓H2SO4,5min后，沸水浴15min，冷水冷却，紫外可见光分光光度计于490nm波长处比色，测定吸光度，做吸光度A与浓度C（ug/ml）线性回归方程。精密称取样品0.04g，稀释定容1000ml，同上法测定其吸光度。3结果与讨论3.1实验结果3.1.1实验数据(1)提取数据a.脱脂：曾选用索氏提取法，现与浸泡法比较如下：表一索氏提取法与浸泡法脱脂的比较索氏提取法取30g研磨过的叶片，于虹吸管中加入350ml石油醚，烧瓶中加入400ml，75oC水浴回流提取5.5h，提取液颜色为黄色；倒出提取液，加入新的石油醚回流提取1h,石油醚颜色不再加深，停止回流。石油醚为淡黄色浸泡法30g研磨过的叶片，用石油醚以15：1（体积：重量）的比例浸泡沙棘叶约24小时，倒出石油醚再以10：1的比例浸泡20～24小时，石油醚浸提液黄色变淡即可。优缺点通过对脱脂后的沙棘叶以及回收石油醚时的剩余物进行称量，发觉质量相差甚微，几乎相等；而且对比石油醚提取液颜色，也相差不大，因而浸泡法操作较索氏提取法更简单，所以本试验选取浸泡法对沙棘叶进行脱脂处理。b.醇析:浓缩液中加入95％的乙醇，使溶液达到不同的醇浓度，其所析出的多糖粗产品如下表：表二浓缩液在不同醇浓度下析出的粗糖产品(2)含量测定数据：本步骤利用苯酚－硫酸法共测定了两组数据，所用样品均为醇沉浓度为80%的第④组产品。所得到的数据见下面两表：3.1.2结果处理（1）相关与直线方程本实验采用相关系数与直线回归方程来检验所测定的数据，相关系数“γ”是测定变量之间相关密切程度和相关方向的代表性指标。但是相关分析不能指出两变量相互关系的具体形式，也无法从一个变量的变化来推测另一个变量的变化关系。而回归方程则是通过一定的数学方程来反映变量之间相互关系的具体形式，以便从一个已知量来推测另一个未知量，为估算预测提供一个重要的方法。（2）数据处理考虑到有几组平行数据，因此用c语言编程，减少运算量，求得线性回归方程与相关系数分别为：第一组：A=0.00734+0.61528C,γ=0.88488第二组：A=0.009654+0.603429C,γ=0.99909从结果中看出第一组数据中γ明显不合要求，故采用第二组数据，作出相应的标准曲线图：由图五可见第二组数据基本呈线性关系，则由标准图可得样品中多糖的浓度为：11.6ug/ml那么可以计算出：a．样品中总多糖的含量为：样品多糖浓度÷样品浓度×100％即：11.6÷20×100％＝58％b．沙棘叶中总多糖的含量：（产品质量×样品多糖含量）÷沙棘叶质量×100％即：（0.991×58％）÷20×100％＝2.84％3.2讨论3.2.1预处理：沙棘叶的预处理很重要，洗掉尘土，便于产品的纯化；叶片不宜过碎，以防热提取时引起糊化。3.2.2提取部分（1）脱脂：脱脂时间不宜过短或过长，过短脂溶性物质溶解不完全，过长则浪费时间；浸泡时宜少量多次，有利于脱脂（2）提取：提取时也是宜于先泡后加热，少量多次水提取。加热的温度不宜过高，80℃即可，高温破坏多糖的活性，低温不利于提取效率。而浓缩时浓缩为原体积的1/3即可，便于脱蛋白时节省试剂。（3）脱蛋白：a.除蛋白时宜采用sevage法，但需反复操作。经实验，剧烈振荡20分钟，然后搅拌5小时，分液漏斗静止分层1小时，两遍即可。采用三氯乙酸法，虽然效果很好，但是反应太剧烈，部分多糖也随之损耗；b.将提取液取少量与碘反应，呈阴性，说明多糖中并无淀粉或量很少，并不需要加α－淀粉酶去除淀粉。（4）醇析：用醇沉淀之前应该浓缩至50ml，便于节省醇用量，节省成本。经实验对比可知随着醇浓度的加大，粗糖产量也随之增大，但是80％和90％的醇沉浓度多糖产率相差不多，且高浓度时极有可能沉淀中包含其他大量杂质，但是其醇的用量相差很大，从表二中看出用量相差几乎一倍。因此从经济角度考虑，采用80％的醇沉浓度即可。（5）干燥：过滤采用无水乙醇，丙酮洗洗数次，尽量不用乙醚，乙醚的沸点很低易挥发往往带入空气中的水分。因此，操作要迅速，且用表面皿盖住，防止吸取空气中的水分，否则多糖很容易成为胶质而变黑变粘，再溶解时需很长时间。真空抽干时一般不宜采用加热，因为多糖很容易炭化。3.2.2纯化分离部分根据不同分子量的多糖在大孔树脂中洗脱出来的先后顺序，便可分时间段收集不同的单一多糖。再依次进行浓