沙门氏菌的检验

沙门氏菌的检验2.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。2.3均质器。2.4振荡器。2.5天平：感量0.1g。2.6无菌锥形瓶:容量500mL，250mL。2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。2.8无菌培养皿：直径90mm。2.9无菌试管：3mm×50mm、10mm×75mm。2.10无菌毛细管。2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。3培养基和试剂3.1缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A中A.1。3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录A中A.2。3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录A中A.3。3.4亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录A中A.4。3.5HE琼脂：见附录A中A.5。3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A中A.6。3.8三糖铁（TSI）琼脂：见附录A中A.7。3.9蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.8。3.10尿素琼脂（pH7.2）：见附录A中A.9。3.11氰化钾（KCN）培养基：见附录A中A.10。3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.11。3.13糖发酵管：见附录A中A.12。3.14邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A中A.13。3.15半固体琼脂：见附录A中A.14。3.16丙二酸钠培养基：见附录A中A.15。1前增菌称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。2增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。3分离分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。4生化试验(1)自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA+(-)＋（－）+可疑沙门氏菌属KA+(-)＋（－）-可疑沙门氏菌属AA+(-)＋（－）+可疑沙门氏菌属AA＋/－＋/－-非沙门氏菌KK＋/－＋/－+/-非沙门氏菌注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性(2)接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）靛基质pH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸脱羧酶A1+---+A2++--+A3----+/-注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。A.1缓冲蛋白胨水（BPW）A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠（含12个结晶水）9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mLpH7.2±0.2A.1.2制法将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121℃，15min。A.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液A.2.1基础液蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠3.0g碳酸钙45.0g蒸馏水1000mLpH7.0±0.2除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH，高压灭菌121℃，20min。A.2.2硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠（含5个结晶水）50.0g蒸馏水加至100mL高压灭菌121℃，20min。A.2.3碘溶液碘片20.0g碘化钾25.0g蒸馏水加至100mL将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中，再投入碘片，振摇玻瓶至碘片全部溶解为止，然后加蒸馏水至规定的总量，贮存于棕色瓶内，塞紧瓶盖备用。A.2.40.5％煌绿水溶液煌绿0.5g蒸馏水100mL溶解后，存放暗处，不少于1d，使其自然灭菌。A.2.5牛胆盐溶液牛胆盐10.0g蒸馏水100mL加热煮沸至完全溶解，高压灭菌121℃，20min。A.2.6制法基础液900mL硫代硫酸钠溶液100mL碘溶液20.0mL煌绿水溶液2.0mL牛胆盐溶液50.0mL临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。A.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液A.3.1成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氢二钠10.0g亚硒酸氢钠4.0gL-胱氨酸0.01g蒸馏水1000mLpH7.0±0.2A.3.2制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液溶液10mL（称取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100mL即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。A.4亚硫酸铋（BS）琼脂A.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4.0g煌绿0.025g或5.0g／L水溶液5.0mL柠檬酸铋铵2.0g亚硫酸钠6.0g琼脂18.0g～20g蒸馏水1000mLpH7.5±0.2A.4.2制法将前三种成分加入300mL蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中，琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀，倒入基础液中，再混匀。调节pH，随即倾入琼脂液中，混合均匀，冷至50℃～55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平皿。注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处，超过48h会降低其选择性，本培养基宜于当天制备，第二天使用。A.5HE琼脂（HektoenEntericAgar）A.5.1成分蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水杨素2.0g胆盐20.0g氯化钠5.0g琼脂18.0g～20.0g蒸馏水1000mL0.4％溴麝香草酚蓝溶液16.0mLAndrade指示剂20.0mL甲液20.0mL乙液20.0mLpH7.5±0.2A.5.2制法将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃～55℃倾注平皿。注:①本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性。②甲液的配制硫代硫酸钠34.0g柠檬酸铁铵4.0g蒸馏水100mL③乙液的配制去氧胆酸钠10.0g蒸馏水100mL④Andrade指示剂酸性复红0.5g1mol/L氢氧化钠溶液16.0mL蒸馏水100mL将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1mL～2mL。A.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂A.6.1成分酵母膏3.0gL-赖氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧胆酸钠2.5g柠檬酸铁铵0.8g硫代硫酸钠6.8g氯化钠5.0g琼脂15.0g酚红0.08g蒸馏水1000mLpH7.4±0.2A.6.2制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃～55℃倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备，第二天使用。A.7三糖铁（TSI）琼脂A.7.1成分蛋白胨20.0g牛肉膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵（含6个结晶水）0.2g酚红025g或5.0g/L溶液5.0mL氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g琼脂12.0g蒸馏水1000mLpH7.4±0.2A.7.2制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2mL～4mL，高压灭菌121℃10min或115℃15min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。A.8蛋白胨水、靛基质试剂A.8.1蛋白胨水蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g氯化钠5.0g蒸馏水1000mLpH7.4±0.2将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121℃高压灭菌15min。A.8.2靛基质试剂A.8.2.1柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。A.8.2.2欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95％乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。A.8.3试验方法挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d～2d，必要时可培养4d～5d。加入柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。A.9尿素琼脂（pH7.2）A.9.1成分蛋白胨1.0g氯化钠5.0g葡萄糖1.0g磷酸二氢钾2.0g0.4％酚红3.0mL琼脂20.0g蒸馏水1000mL20%尿素溶液100mLpH7.2±0.2A.9.2制法除尿素、琼脂和酚红外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂后分装，121℃高压灭菌15min。冷至50℃～55℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2％。分装于无菌试管内，放成斜面备用。A.9.3试验方法挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。A.10氰化钾（KCN）培养基A.10.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸二氢钾0.225g磷酸氢二钠5.64g蒸馏水1000mL0.5％氰化钾20.0mLA.10.2制法将除氰化钾以外的成分