注射用三磷酸胞苷二钠的溶血性过敏性及血管刺激性研究

作者简介：王秋菊，女，硕士研究生*通讯作者：张予阳，女，教授，博士Tel:[phone]E-mail:[e-mail]1注射用三磷酸胞苷二钠的溶血性、过敏性及血管刺激性研究王秋菊1，吕娟2，梁晨1，张予阳1*（1．沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳110016；2．沈阳药大药业有限责任公司，沈阳110016）摘要：目的考察注射用三磷酸胞苷二钠的体外溶血性、全身过敏性及在注射时对局部血管是否有刺激作用。方法分别以家兔和豚鼠为受试动物，给予注射用三磷酸胞苷二钠，观察豚鼠有否全身过敏反应。观察给家兔连续多次注射此药后，局部血管有无红肿、充血、出血和坏死等刺激作用。用家兔红细胞为标本，观察该注射液有否体外溶血作用。结果注射用三磷酸胞苷二钠对豚鼠无全身过敏反应。家兔血管滴注部位未出现明显的红肿、充血、坏死等刺激反应。对家兔红细胞未产生溶血和凝集作用。结论注射用三磷酸胞苷二钠无血管刺激性、过敏性及溶血性。关键词：注射用三磷酸胞苷二钠；过敏性；溶血性；血管刺激性中图分类号：R965文献标识码：AStudyofhemolysis,hypersensitivityandstimulationonbloodvesselofsodiumcytidinetriphosphateinjectionWANGQiu-jv1,LVJuan2,LIANGChen1,ZHANGYu-yang1*(1.SchoolofLifeScienceandBiopharmaceutics,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;2.ShenyangYaodaPharmaceuticalCo.,LTD.,Shenyang110016,China)ABSTRACT:OBJECTIVEToobservethehemolysisinvitro,stimulationandhypersensitivityofsodiumcytidinetriphosphateinjection.METHODSThestimulatedreactiononrabbits’bloodvessel,thehemolysisandagglomeratedreactiononrabbits’redcellsinvitroandthehypersensitivityreactioninguine-pigofsodiumcytidinetriphosphateinjectionwerestudied.RESULTSTheresultsshowedthatnostimulationonbloodvessel,nohemolysisandagglomerationonredcellsandnohypersensitiveactioninguinea-pig.CONCLUSIONSodiumcytidinetriphosphateinjectionhasnohemolysis,hypersensitiveandstimulativereaction.KEYWORDS:sodiumcytidinetriphosphateinjection;hypersensitivity;hemolysis;stimulation三磷酸胞苷二钠(sodiumcytidinetriphosphate，CTP)是一种核酸类药物，可提供细胞代谢所需要的能量，对于稳定细胞膜、维持神经元的存活起重要作用，同时具有促进受损神经细胞的修复、再生等多种作用[1]。近年来，该药在临床上广泛用于辅助治疗如脑梗死等急性脑血管病、充血性心力衰竭、新生儿缺血缺氧性脑病及糖尿病周围神经病变等疾病引起的神经损伤。为了评价注射用CTP的安全性,更好的为临床安全用药提供理论依据,本研究利用家兔和豚鼠为受试动物，对其血管刺激性、致敏性及溶血性进行了临床前实验性评价。1材料与方法1.1药品与试剂注射用三磷酸胞苷二钠（沈阳药大药业有限责任公司）；阴性对照药，0.9%氯化钠注射液（沈阳志鹰制药厂）。1.2实验动物大耳白家兔，2.5～3.0kg，雌雄兼用；白色豚鼠，210～230g，雌雄各半（沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（辽）-2003-0012号）。1.3过敏试验[2-4]取豚鼠18只，按体重随机分为3组，6只/组。致敏：阴性对照组ip0.9%氯化钠注射液2mL/只，阳性对照组ip2%的新鲜鸡蛋清0.5mL/只，受试药物组ip注射用三磷酸胞苷二钠（2mg·mL-1），2mL/只，隔日1次，共5次。致敏期间每日观察各豚鼠的状态，初次和末次致敏及激发当日称量各豚鼠的体重，观察2是否有异常改变。激发：末次给药后14d，阴性对照组iv0.9%氯化钠注射液4mL/只，阳性对照组iv2%的新鲜鸡蛋清1mL/只，受试药物组iv注射用三磷酸胞苷二钠(8mg·mL-1)，4mL/只，给药后立即至30min按附表A所示详细观察并记录各豚鼠的过敏反应症状，并按附表B对注射用三磷酸胞苷二钠进行全身致敏作用评价。附表A过敏反应症状0正常7呼吸急促14步态不稳1不安宁8排尿15跳跃2立发9排粪16喘息3发抖10流泪17痉挛4搔鼻11呼吸困难18横转5喷嚏12罗音19潮式呼吸6咳嗽13紫癜20死亡附表B全身致敏性评价标准症状判定评价0-过敏反应阴性1－4症状+过敏反应弱阳性1－10症状++过敏反应阳性1－19症状+++过敏反应强阳性20++++过敏反应极强阳性1.4血管刺激性试验[2,3]取大耳白家兔3只，每只家兔分别于左耳静脉缓慢注射三磷酸胞苷二钠8mg·4mL·kg-1，右耳注射等容积的0.9%氯化钠注射液，进行同体自身对照研究，1次/d，连续5d，每天给药前后及末次给药后48h对家兔注射部位进行肉眼观察并记录，观察注射部位的血管及周围组织是否有红肿、丘斑等刺激反应，结果按附表C进行血管刺激反应肉眼观察评分。观察期结束后将家兔处死，剪取离注射部位1cm及5cm远的血管及周围组织，10%甲醛液中固定，石蜡包埋，HE染色，进行组织病理学检查，结果按附表D进行血管刺激反应光镜检查评分。附表C血管刺激性肉眼观察评分标准观察指标评分结果判断（按总分）血管充血正常0≤0.5无刺激性充血1血管纹路不清2≤2.5轻微刺激血管呈紫红色3周围组织水肿无水肿0≤4.5中度刺激轻微水肿1明显水肿2≤6.0重度刺激严重水肿33附表D血管刺激性光镜检查评分及结果判定标准观察指标评分结果判断（按总分）血管充血内皮及管壁完整0≤0.5无刺激性内皮受损1血管内有血栓2≤2.5轻微刺激血管破裂3周围组织水肿正常0≤4.5中度刺激水肿1出血2≤6.0重度刺激炎细胞浸润31.5体外溶血性试验[3,4]兔耳中央动脉取20mL血液，放入含玻璃珠的三角烧杯中，振摇10min，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液，然后加入10倍量的0.9%氯化钠注射液，混匀，离心（1500rpm，10min），取沉淀的红细胞，再如此洗涤数次，直至上清液无红色，将所得红细胞用0.9%氯化钠注射液配成2%的红细胞悬液备用。取7只试管，按附表E所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠注射液、蒸馏水及注射用三磷酸胞苷二钠（2mg·mL-1），混匀，立即于(37±0.5)℃恒温箱中温育，分别于置温箱后15min、30min、45min、60min、2h、3h仔细观察，按“化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则”的标准（附表F）对是否有溶血及红细胞凝集进行判定。附表E体外溶血试验加样表（mL）试管号12345672%兔红细胞悬液2.52.52.52.52.52.52.50.9%氯化钠注射液2.02.12.22.32.42.5…蒸馏水………………2.5三磷酸胞苷二钠(2mg/mL)0.50.40.30.20.1……附表F体外溶血试验判定标准判定所见现象溶血（＋）溶液呈澄明红色，管底无细胞或有少量细胞残留无溶血（－）红细胞全部下沉，上清液无色澄明红细胞凝集（*）溶液中有红棕色絮状沉淀物，振摇后不分散2结果2.1过敏试验致敏期间各豚鼠的饮食、活动等状态均正常，比较0.9%氯化钠注射液组与三磷酸胞苷二钠组豚鼠的初次和末次致敏及激发当日的体重，未见异常差异，且两组豚鼠的体重均有所增加。末次给药后14d激发时，2%的新鲜鸡蛋清组的各豚鼠均不同程度地出现搔鼻、喷嚏、咳嗽、抽搐、大小便失禁、步态不稳、跳跃、喘息、休克等过敏反应症状，且多数于15min左右死亡，过敏发生率100%，呈强至极强阳性过敏反应。0.9%氯化钠注射液组及三磷酸胞苷二钠组的豚鼠无一例出现过敏症状，过敏反应均为阴性。表明，注射用三磷酸胞苷二钠对豚鼠无全身致敏作用(表1)。4表1注射用三磷酸胞苷二钠豚鼠全身过敏性试验结果Tab.1Effectofsodiumcytidinetriphosphateinjectiononthehypersensitivityreactioninguine-pig组别动物数过敏反应数判定评价2%新鲜鸡蛋清66+++~++++强~极强阳性0.9%氯化钠注射液60-过敏反应阴性注射用三磷酸胞苷二钠60-过敏反应阴性2.2血管刺激性试验家兔连续5d耳缘iv给三磷酸胞苷二钠后，肉眼观察注射部位及远离注射处血管及组织，均未见出血、淤血、水肿等异常改变，与注射0.9%氯化钠注射液的对照侧耳部血管相比无明显差异，肉眼观察评分结果见表2。评分结束后，处死家兔，取两耳注射部位的血管及周围组织进行病理学检查。结果可见，注射用三磷酸胞苷二钠组的兔耳1cm及5cm处血管内未见血栓，血管内皮细胞未见肿胀、增生、血管外周围组织均未见出血、坏死及炎性细胞浸润等病理改变，0.9%氯化钠注射液组的兔耳1cm及5cm处血管内及血管外也均未见任何异常病理性改变，光镜检查评分见表3。结果表明，连续5d给家兔耳缘iv注射用三磷酸胞苷二钠对局部血管无刺激作用。表2注射用三磷酸胞苷二钠血管刺激肉眼观察评分Tab.2Thevisualinspectionratingscoresofsodiumcytidinetriphosphateinjectiononthestimulatedreactioninrabbits’bloodvessel组别兔耳数（只）剂量肉眼观察评分评价0.9%氯化钠注射液3…0无刺激性注射用三磷酸胞苷二钠38mg·kg-10表3注射用三磷酸胞苷二钠血管刺激光镜检查评分Tab.3Thelightmicroscopeinspectionratingscoresofsodiumcytidinetriphosphateinjectiononthestimulatedreactioninrabbits’bloodvessel组别兔耳数（只）剂量光镜观察评分评价1cm5cm0.9%氯化钠注射液3…00无刺激性注射用三磷酸胞苷二钠38mg·kg-1002.3体外溶血试验结果由表4可见，蒸馏水对照管（阳性对照）因体系不等渗而致红细胞破裂，发生溶血，形成红色澄明溶液。0.9%氯化钠注射液对照管（阴性对照）与各三磷酸胞苷二钠管（被试管）在所观察的时间内均无溶血及红细胞凝集发生。表明，注射用三磷酸胞苷二钠在常规体外试管法试验中，对家兔血液无溶血作用。5表4注射用三磷酸胞苷二钠体外溶血性试验结果Tab.4Effectofsodiumcytidinetriphosphateinjectiononthehemolysisandagglomeratedreactiononrabbits’redcellsinvitro被试物与红细胞接触的时间各剂量三磷酸胞苷二钠（2mg·mL）+0.9%氯化钠注射液0.9%氯化钠注射液蒸馏水0.5+2.0mL0.4+2.1mL0.3+2.2mL0.2+2.3mL0.1+2.4mL2.5mL2.5mL15min－－－－－－＋30min－－－－－－＋45min－－－－－－＋60min－－－－－－＋2h－－－－－－＋3h－－－－－－＋注：“＋”为溶血，“－”为无溶血