流式细胞术的质量控制

流式细胞术的质量控制和影响因素河北省肿瘤研究所左连富一、标本的采集和固定方法的质量控制标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程，需注意：①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。②标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度固定效果好，高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致使细胞内的物质固定不良，有作者分析研究了自溶对DNA测定的影响，发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体，且不固定的组织细胞随时间的延长，DNA含量呈梯度降低，根据检测的目的，选择什么类型的固定剂，对流式检测质量也有显著的影响，例如细胞DNA的分析，使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度，实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右。如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织是最好的选择，在不能及时检测又没有低温保存条件时，要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失，失去标记的位点。如所测抗原物质在细胞内，可以使用醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱(0-4℃)放置即可，能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。二、单细胞悬液制备的质量控制人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料，其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态，它是流式分析最合适的样品来源，全血中含有多种有形成分，流式细胞检测是以某一群细胞为检测对象，因此在检测前须将所测的某群细胞成分分离出来，例如，以淋巴细胞DNA定量分析为例，就须把淋巴细胞分离出来，而将其他有核细胞或红细胞去除，对于血小板的分析样品制备过程中须防止过高离心速度造成血小板膜的损伤，出现血小板凝集。新鲜实体组织单细胞样品的制备，实体组织是流式分析工作的主要材料来源，但对其分散单细胞样品的技术和方法，仍存在着很多问题，仍需大量的探索工作，就目前，国内外对实体组织分散单细胞还没有找到一个适用的又通用方法，甚至同样组织，用于不同的实验目的，就需要不同的方法处理，或者每一种组织就是一个单独的问题，因此必须根据实际情况，去选择合适有效的单分散方法，选用的方法必须达到细胞产量高，细胞损伤小的目标，但实际工作中达到这个目标是困难的，多年来对于实体组织的分散解聚多采用酶学法，化学法、机械物理方法以及低渗脱核方法等，根据各种组织的特点，以及实验目的的不同，可选择不同的方法。①选则酶学方法时，应注选择使用酶类型的问题，含有大量结缔组织的组织器官，选择胶原酶好，不宜选择胃蛋白酶或膜酶，并要注意酶的活性条件和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间，pH值，浓度等方面对酶活性的影响，酶学方法分散组织都有一定的应用限制，特别用于流式免疫荧光实验时，酶处理可能改变或丢失膜的抗原成分，从而影响分析结果，由于酶学方法分散下来的细胞产量低，用组织较多，还要注意酶的纯度，活性单位，以及生产厂家对酶的污染。②化学方法，往往单独应用分散组织效果不理想，应与酶学方法综合使用，分散效果更佳。③机械方法，常采用剪碎，网搓研磨，细针抽吸等，对细胞损伤大，产生的细胞碎片多，细胞团块多，在使用机械法时，要给于组织适当的压力，这种适当的压力需要有较多的制样实践经验技术人员来操作。④低渗方法，其溶液是一种低渗液体，造成细胞膜的破坏，使细胞核自行释放出来，是一个裸核悬液样品，本方法简便，可以改变样品的变异系数，但要避免脱核时间过长，造成核膨胀碎裂。以上几种方法是目前对实体组织解聚常用的方法，往往不是单用，常常是一种或二种方法的结合使用，总的来说，对实体组织分散为单细胞还存在很多困难，因此还需要深入探讨流式样品的制备技术，制备出完整细胞产量高，细胞损伤小的合格悬液,获得更好的流式检测结果。三、石蜡包埋组织单细胞制备的质量控制石蜡包埋组织标本的材料选择，应经病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死的组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组织细胞丰富的区域，且经病理形态或细胞学核实病理诊断。切取适当厚度的石蜡组织片，大量研究证明，切取40-50μm厚度的切片是适宜的，过厚的组织片消化费时，消化下来的细胞数少，过薄的切片可产生大量的细胞碎片，影响检测结果，使肿瘤异倍体的检出率减少，我们研究了石蜡切片不同厚度(5,10,20,30,40,50μm)对流式分析DNA影响发现较薄的切片造成碎片较多,噪音增加,组方图的基线提高,影响倍体分析的精度。在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石蜡可，影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的方法是弃去二甲苯(Hedley强调用Histoclear，即组织清洗剂代替二甲苯脱蜡，效果更好)，加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，示蜡已脱净梯度酒精(100%70%50%)水化要充分,使组织还原到与新鲜组织相似的状态。消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等，不造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要，时间短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用0.5%胃蛋白酶PH1.5。石蜡包埋组织的单细胞制备方法的建立，使流式细胞术在医学研究中得到更广泛的应用，但仍存在一些问题有待进一步解决，主要存在问题如下：⑴样品中的碎片较多，所测得的DNA组方图质量不及新鲜组织好，组方图的峰位较宽CV值偏大。⑵异倍体率减少，由于组方图细胞峰CV值较大，一些近于二倍体的DNA异倍体峰被掩盖。⑶S期细胞百分比不如新鲜组织的S期计算精确，S期细胞的计算偏高，这仍然与CV值较大有关⑷DNA二倍体标准不稳定，Schutter等发现用新鲜正常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞DNA含量(例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等)作为石蜡包埋组织细胞DNA含量的标准不适用，石蜡包埋组织比新鲜组织细胞DNA荧光强度低，且样品间的荧光强度不稳定，解决DNA二倍体标准不稳定的办法，可将正常组织与肿瘤组织作为一个内标的二倍体标准参照，可减少DNA倍体分析的误差，对存档中的石蜡包埋组织材料，可以采用正常组织石蜡包埋标本，作为一个外参的二倍体标准，但要求采用的外参二倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品(例如鸡血细胞等)。四、脱落细胞样品的采集脱落细胞样品的采集要保证足够的细胞数，在临床实际工作中，可以收集到大量自然脱落的细胞标本，这些细胞标本经简单处理后，即可得到较好的单分散细胞，例如胸腹水，内镜刷检细胞，膀脱冲洗液等，这些材料得到的流式检测结果，要小心谨慎的分析解释，结果的生物学意义，因这些材料获得前结果常出现阴性或假阳性结果，因其中的白细胞常有变性，且样品细胞数量少，制备出一个合格的单细胞样品，其细胞数要求在1×106/ml，其杂质碎片团块重叠细胞应小于2%以下，否则应放弃检测，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品中，至少应有20%的肿瘤细胞存在，(因占主峰1/5以上的异倍体峰才可确认为异倍体)。五、细胞悬液荧光染色的质量控制单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分析的精度很重要，目前常使用的荧光染料有EB、PI、DAPI、AO、FITC、PE等，对细胞染色时应特别注意染料的特性及量效关系，定量细胞学荧光染色易受到多种因素的影响，以致造成不正确的测定结果，了解荧光染色的影响因素，将有助于在荧光定量细胞学分析中，尽可能避免测量误差，并进行有效的校正措施，如下的一些常见影响因素需特别注意。⒈温度对荧光染色强度的影响：在一般情况下，环境温度的升高对荧光染色有明显的影响，温度升高可造成溶液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子的动力增大使荧光猝灭的可能性增加，这就使荧光分子和其他分子之间的相互碰撞几率增加，因此，影响了荧光分子发光量子产额。一般认为，温度升高时，荧光减弱，荧光减弱的百分比称温度系数，就一般荧光物质而言，温度系数大约为1%，如果温度在20℃时，一般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温度的升高，荧光猝灭作用越强以致造成完全猝灭，温度在20℃以下，荧光分子发光量子产额的变化不明显，基本上保持恒量，因此在荧光测定时要保持染色后的样品在适当低温环境下选行，尽可能减少样品的照射时间，有条件时应使样品观察室做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结果。2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：在溶液较稀时，荧光强度与浓度成比关系，随浓度加大，荧光强度也增大，当荧光染料达到一定浓度时，如继续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应的增加，反而使荧光强度减低，这种因染料浓度增大使荧光量子的产额下降的现象称为浓度猝灭现象，因此在研究浓度与荧光强度关系时，必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的浓度，还是曲线高峰后的浓度(方法是减少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓)。浓度造成荧光猝灭原因,主要是缔合分子形成,缔合分子中的电子共振作用,而消耗了激发分子的能量而参与猝反作用。实验表明，当溶液稀释后，荧光染料分子之间的相互作用完全消失时,荧光量子产额最大，荧光强度发射最强，当溶液浓度增加时，荧光分子之间发生碰撞效应，各能级间的干扰明显增加，从而引起荧光量子产额下降，另一个主要原因由于荧光染料浓度增加过大时，造成荧光分子不均匀分布，靠近入射光面的吸收光强，而进入溶液深层时，光吸收越少，发出的荧光分子也越少，称这种现象为内滤光效应(InterfilterEf-fect)。鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影响之大，因此要选择最合适的浓度，对于荧光定量检测技术是极其重要的。3.pH值对荧光发射强度的影响：荧光分子在溶剂中处于离子化状态，因此，溶液中的氢离子浓度对荧光强度影响极大，荧光分子发光的最有利条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从而通过染料分子本身所具有的斥力作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，每一种荧光分子的发光量的产额最高，都有自己合适的pH值。4.其他一些影响荧光强度的因素：像醛类固定剂(戊二醛，甲醛),可以干扰荧光染料与核酸分子的结合,像溶剂中的一些不发光的物质(如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、铁、银离子等)均可造成荧光的猝灭现象。六、流式细胞仪器操作技术的质控为使流式细胞在整个实验过程中，各种液流系统电子和各个光学系统的调整处于最佳工作状态，能保证定量检测的准确性和检测精度，应调整仪器的变异系数在最小范围，分辩率在最好的状态，为避免在测量过程中仪器条件的漂移，可能引起定量检测的误差，一个校正仪器的参考标准样品的使用是必不可少的。1.对流式细胞仪的线性校正常使用不同大小的荧光微球来测量，仪器的线性会对细胞的定量分析的精度产生显著影响，如果仪器处于非线性状态，对定量细胞DNA含量和细胞周期分布有重要的影响，在定量分析时常常使用的是线性测量，所以对于校正仪器线性的精度尤为重要。2.流式细胞仪的变异系数(CV值)流式细胞仪的变异系数是光学元件校正，准值的精确度，CV值是评价仪器精度的很重要的指标，仪器是否准直。校正是通过一个非生物样品(荧光微球)或生物细胞样品(人淋巴细胞，鸡细细胞等)的检测来验证，这校正仪器的样品即为标准样品，其物理性质、生物学性质、化学性质相对一致。对于这样一个标准样品，其CV值应越小越好，CV值越小说明仪器准直校正的精度越高，对于一个非生物的荧光微球，一般CV值在2-3.0%左右。对于其他正常二倍体细胞含量的组方图的CV值应小于8%，如果大于8%，这个样品应舍掉，对于肿瘤细胞样品的CV值可以大于8%，这与肿瘤细胞异质性有关，对于生物细胞样品本身的生化成分含量的异质性大小，固定方法，处理程序和荧光染色等都可能造成CV值的变化。一般认为，实测结果CV值包括两部分，一个CV值是使用标准样品测得的仪器CV值，另一个CV值是实验样品所测得的值，这个CV值，是实验样品和仪器CV值的总和。⒊对于校正仪