无菌检测标准操作规程(培养法)

无菌检测标准操作规程StandardOperatingProcedureofSterileExamination编号/NO：版本号/Version：页码/Page起草人：起草日期：审核人：审核日期：批准人：批准日期：颁发部门Issuedby执行日期EffectedDate替换文件Replacedfor复审日期ReviewDate分发部门Distributedto武汉仝干生物科技有限公司WuhanTogoBiotechnologyCo.,Ltd无菌检测标准操作规程StandardOperatingProcedureofSterileExamination编号/NO：版本号/Version：页码/Page：1、目的建立无菌检测的基本操作，为无菌检测人员提供正确的操作规程。通过无菌检验后，确保产品能够达到无菌的要求。2、适用范围适用于我公司进行细胞质量检验的技术人员。3、内容3.1简述：无菌检测系用于检查细胞是否无菌的一种方法。检查项目包括需氧菌、厌氧菌及真菌检查。若供试品符合该项检查方法的有关规定，仅表明在该检验条件下未发现微生物污染。3.2环境要求：该项检查应在环境洁净度万级背景下的局部百级的单向流区域内或隔离系统中进行。其过程必须严格遵守无菌操作，日常检验需对试验环境进行监控。3.3人员要求：无菌检测人员应具备微生物及检验专业知识，并经过无菌检验培训。4、无菌检验前的准备4.1器具灭菌、消毒试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌，可置高压灭菌锅内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理，如无菌检验室的电子天平，工作台面等，可采用消毒剂浸泡或擦拭。器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时间和使用有效期。4.2人员、物料进入无菌检验室开启紫外灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时间不得少于30分钟。人员进入无菌检验室需在一更区脱去一般区工作鞋，换无菌检验室工作鞋，并在二更区穿戴无菌服、口罩和手套，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。进入无菌检验室的所有培养基、供试品等需将外包装在传递窗拆除后，查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内，符合要求的于传递窗进行表面紫外消毒，传入无菌检验室。5、无菌检验室操作要求1）人员进入后，首先进一步消毒擦拭工作台面。2）全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。3）使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。4）所有操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。5）使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。6）在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，造成污染。7）操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡或消毒桶内，或在检验完成后经传递窗传至一般区，立即用压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟。6、培养基制备6.1需氧菌、厌氧菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基）的制备所用试剂：酪胨（胰酶水解）15.0g葡萄糖5.0gL-胱氨酸0.5g硫乙醇酸钠0.5g（或硫乙醇酸）（0.3ml）酵母浸出粉5.0g氯化钠2.5g新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml琼脂0.75g水1000ml制备：除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH为7.1±0.2。硫乙醇酸盐流体培养基氧化层的颜色要求：在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否刚需经100℃水浴加热到粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。6.2霉菌培养基（改良马丁培养基）的制备所用试剂：胨5.0g酵母浸出粉2.0g葡萄糖20.0g磷酸二氢钾1.0g硫酸镁0.5g水1000ml制备：除葡萄糖外，取上述成分混和，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH为6.4±0.2。还可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基，按照使用说明书配制。培养基配制后应尽快灭菌，避免微生物繁殖。一般采用高压蒸汽121℃灭菌30分钟。制备好的培养基应在2～25℃保存，在3周内使用。6.3培养基的无菌性检查每批配制的培养基均应进行无菌性检查（可与产品无菌检验同步进行）。检查时，每批培养基随机取不少于5支（瓶）培养14天，应无菌生长。7、稀释液、冲洗液的制备0.1%蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装后置入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌30分钟后，于4℃保存备用。pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钾7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml。微温溶解，滤清，分装后置入高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌30分钟后，于4℃保存备用。浸提介质：9g/L无菌氯化钠溶液。8、对照菌液制备无菌检验所用的菌株传代次数不得超过5代。取金黄色葡萄球菌的普通琼脂斜面培养物，接种至营养琼脂培养基内，在30～35℃培养18～24h后备用，同时制备0.9%氯化钠溶液加入6支小试管内，每支试管内加9.0ml的0.9%氯化钠溶液，在高压灭菌锅内经121℃灭菌30分钟备用。将已配好的金黄色葡萄球菌培养菌液取1.0ml加入第一支小试管内，稀释成浓度1:10的菌液；取第一支试管内1.0ml菌液加入第二支小试管内，稀释成浓度1:100的菌液，同法稀释成浓度1:106（每ml含菌量≤100CFU）即可。采用平皿计数法测定活菌数。9、无菌检验培养温度硫乙醇酸盐流体培养基，置30～35℃培养。改良马丁培养基，置23～28℃培养。10、无菌检验灭菌前、后菌片应按菌片说明书规定条件保存。10.1接种开启单向层流，分别将灭菌后的菌片成对放入已灭菌的硫乙醇酸盐流体培养基中，同时以金黄色葡萄球菌作阳性对照，以未接种的硫乙醇酸盐流体培养基和未接种的改良马丁培养基作为阴性对照。10.2培养阳性对照管于30~35℃细菌培养箱培养48~72小时，其余硫乙醇酸盐流体培养基于30~35℃细菌培养箱培养7天。10.3结果判定培养后，阳性对照应有菌生长，阴性对照和被检样品未见需氧菌、厌氧菌和霉菌生长的即为合格。11、质量记录《无菌检验原始记录》《菌种外购、转种记录》《培养基制备记录》《实验中废弃的带菌物品灭菌处理记录》《实验用稀释液、冲洗液、缓冲液制备记录》