核基质与现代医学专题八

专题八：核基质与现代医学1、核基质与肿瘤医学概述核基质的研究经过20多年的发展,其研究内容远超出了形态学方面的分析。业已证明：活性转录基因优先与核基质相连；RNA合成和未成熟的RNA拼接位点锚定于核基质；细胞周期进行性调节元件与核基质结合；转录后修饰的蛋白激酶也与核基质相关；Merriman等研究核基质与骨钙素基因启动子的相互作用时发现，一种组织特异性的核基质蛋白NMP2可以和骨钙素基因启动子结合，从而调节基因的转录；此外，一些重要的抑瘤基因p53，pRb和瘤基因c-Myc的蛋白也是核基质结合蛋白。新近报道:细胞周期调节蛋白P21/WAF1/CIP1也是核基质结合蛋白。另外，一些DNA肿瘤病毒蛋白HPVE7和EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3C也属核基质结合蛋白。这些资料表明，细胞内的许多重要事件与核基质密切相关。细胞发生癌变时，这些重要事件表现更为活跃，同时还伴有一些与肿瘤发生相关的核基质蛋白出现，这为寻找肿瘤特异抗原提供了一条新的途径。研究表明，细胞在癌变的过程中，其核基质及核基质蛋白会发生形态和生化上变化。这些改变必将导致DNA的拓扑结构及基因与核基质相互作用的改变，相应的改变会反作用于癌变的过程，从而引起一系列相关的连锁反应。由于核基质蛋白本身具有组织特异性，而且这种特异性在癌变后的细胞中更为明显。因此对核基质蛋白的深入研究有助于建立新的肿瘤检测技术和治疗方法。近年来，活性核基质蛋白成分、结构和功能在肿瘤发生、演进中的作用一直是研究的热点问题之一。目前的研究主要集中在以下四个方面：1.核基质蛋白与肿瘤的发生；2.核基质蛋白与肿瘤的演进和转移；3.核基质蛋白与肿瘤病理诊断；4.核基质蛋白作为肿瘤化疗的靶标。1.1、核基质蛋白与肿瘤的发生癌基因的激活和抑癌基因的失活在肿瘤的发生中起重要作用。抑癌基因p53和它的类似物p73可以结合于核基质。DNA损伤后，这种结合增强。p53和核基质的相互作用可以被F-肌动蛋白调节。抑癌蛋白pRb在细胞增殖和分化的调节中起关键作用，也是一种核基质相关蛋白。核基质蛋白LaminA与pRb结合，可防止pRb被蛋白酶降解。研究发现，15%以上的肿瘤有病毒性因素。整合于肿瘤细胞的病毒基因位于MARs的附近，然而非病毒性肿瘤的基因变化却和这些区域没有显著的相关性。在食管癌、子宫颈癌等，人乳头瘤病毒E6E7癌基因存在于核基质相关DNA中。整合于宿主细胞的病毒基因可通过MARs控制转录调节，进而引起病毒性肿瘤。1.2、核基质蛋白与肿瘤的演进和转移肿瘤的重要特征是演进和转移，也是肿瘤预后不良的重要原因。Spencer等利用乳腺癌进展过程的各阶段系列细胞系，通过双向凝胶电泳对核基质蛋白质和顺铂在原位与DNA产生交联的蛋白质进行了分析，发现乳腺癌的演进与结合于细胞核DNA的NMPs的改变相关。在结肠癌的肝转移中，Brunagel等发现3种在结肠癌出现的核基质蛋白，也出现结肠癌肝转移的癌组织中，但在正常肝组织和肝细胞中不出现。这些蛋白显示了结肠癌肝转移的特殊性，可能在肿瘤转移中起重要作用。在具有不同转移潜能的黑色瘤细胞系中，EGFR基因片断紧密结合于核基质，它们的结合与黑色素瘤细胞系WM451和WM35具有不同的转移潜能相关。1.3、核基质蛋白与肿瘤病理诊断肿瘤病理诊断的主要指标是核形，异常的核形可以看作癌细胞的重要病理特点。核基质是有活力的RNA-蛋白网络，在决定核型方面发挥作用。通过这一蛋白网络，它可以组织染色体结构，参与复制和转录。进一步的研究发现，参与转录、染色体修饰和选择性剪切的蛋白酶在核基质上有特殊的结合位点。核基质具有组织和细胞的特异性，并且与细胞的转化和分化状态有关。目前，人们已从结肠癌、膀耽癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等癌组织或细胞中分离并鉴定出数种与特定组织癌变相关性核基质蛋白成分，核基质蛋白作为肿瘤标志物已经得到认同，成为判断疾病状态的一个有用指标，其中的NMP22已用于膀胧癌的临床诊断。1.4、核基质蛋白作为肿瘤化疗的靶标肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，因此肿瘤的治疗也涉及到许多因素。抗癌药物可通过多种机制来干扰肿瘤细胞的生长和生存。有些抗癌药物发挥细胞毒作用的一个重要机制就是诱导细胞核的损伤，在核基质水平上诱导细胞死亡。研究表明核基质的多种结构和功能单位可能是某些药物的作用靶点。例如DNA拓扑异构酶II活性药物、烷化剂、离子射线等抗癌药物均优先与核基质靶蛋白相互作用，这也是这些药物发挥抗癌效应的关键之一。正常细胞随机用烷化剂处理时，MARS及其附近的DNA会被选择性的破坏。某些抗代谢药物及抗拓扑异构酶活性药物则主要抑制核基质相关酶的活性。早幼粒细胞白血病蛋白PML是核基质相关蛋白，形成PML核体，具有内在的抗病毒活性，抑制肿瘤的生长、参与造血祖细胞分化、调节基因转录、诱导细胞凋亡等。在急性早幼粒细胞白血病中，t(15,17)的易位可以形成由核基质蛋白、PML和维甲酸受体所形成的融合蛋白，PML核体被破坏。当用全反式维甲酸诱导分化或被As2O3引发凋亡时，PML核体可以重新形成。PML与泛素化相关肤Sumo-1相结合，这一过程可被As2O3加强，正是由于PML与核基质的相互作用。综上所述，探讨肿瘤细胞核基质蛋白的改变，不仅有利于寻找肿瘤标志物，也有助于阐明肿瘤活性基因表达调控机理并发现肿瘤治疗新的药物靶点。2、核基质与癌基因、抑癌基因核基质与肿瘤的关系也十分密切，一些与肿瘤发生相关的病毒、癌基因和抑癌基因蛋白是核基质蛋白或核基质结合蛋白，癌基因和抑癌基因产物是在核基质结构上发挥作用。SV-40T与p53、HPVE7与pRb、pRb与c-Myc、p53与WAF1/cip1等的相互作用也是在核基质网络上进行。2.1、癌基因产物与核基质的关系研究表明:v-Myc和c-Myc蛋白与核结合有三种类型:a、低盐和高盐抽提去除DNA和RNA的细胞残核保留了大部分(60%～90%)的Myc蛋白；b、完整的细胞核在低盐缓冲液中经核酸酶消化DNA可释放1%的Myc蛋白；c、用低盐和去污剂抽提却得不到10%的Myc蛋白。显然，用制备核基质的高盐方法所得的抽提物含有大量的Myc蛋白，这些Myc蛋白与单链和双链DNA具有亲和性。经盐和核酸酶抽提的细胞残核用抗Myc蛋白抗体的荧光分析显示：Myc蛋白是与复杂的残留核结构——核基质相结合。用分离的HL-60核基质与32P末端标记的c-myc片段进行结合的实验表:c-myc瘤基因的MAR可与HL-60细胞株的核基质蛋白结合。经不同的方法抽提核基质后，Myc蛋白仍与核基质牢固结合。尽管在细胞周期中c-Myc蛋白水平无明显的改变，但是，这种核基质结合的c-Myc蛋白在S期比G2期更高；免疫电镜也证实c-Myc的信号在核基质中比在未分步处理的细胞核中更强，c-Myc蛋白与核基质网络更易结合。以上资料说明：c-Myc瘤蛋白是一种核基质结合蛋白，它与细胞核基质的结合与其功能密切相关。在肿瘤细胞中癌基因egfr通常表达或高表达。Egfr的表达在肿瘤发生发展中发挥重要作用。目前封闭EGFR治疗肿瘤已成为一个研究热点。封闭EGFR行使功能的策略有:下调EGFR表达，阻止EGFR活化和/或磷酸化，抑制EGFR下游信号传导。Chew等研究了胶质母细胞瘤和黑色素瘤细胞株中egfr基因与核基质的关系，他们的研究表明细胞恶性程度越高，egfr基因与核基质的结合越紧密，而且egfr基因的非编码区(相当110bp片段)与核基质结合的紧密程度大于编码区(相当于939bp片段)。他们还发现egfr基因与核基质的结合与黑素瘤细胞的转移能力有关：转移能力高的细胞株中egfr基因的940bp片段与核基质的结合强度大于转移能力低的细胞株。应用免疫组化和Western印迹方法证明TCA8113中高表达EGFR，而且通过核基质DNA的PCR扩增，发现TCA8113细胞中egfr基因的两个片段均与核基质结合，当DNaseⅠ浓度加至100μg/ml，这两个片段仍能扩增出阳性片段，说明在该细胞中egfr基因的这两个片段与核基质蛋白紧密结合，即使应用数10倍DNaseI(完全消化核基质上DNA的浓度)的量，也不足以将与核基质结合的egfr基因片段降解。说明核基质蛋白能够很好地保护这部分egfrDNA片段不被DNaseI消化。活性表达的基因通过一部分基因片段与核基质相结合，通过核基质蛋白来调控与之相结合的基因2.2、抑癌基因产物与核基质的关系研究得较多的抑癌基因是p53、pRb、p21/WAF1基因。它们的产物都是细胞核基质结合蛋白，其共同点是参与细胞周期和细胞生长的调节，三者协同作用，有效地控制细胞生长。2.2.1、p53通过制备Meth-A(甲基胆蒽转化细胞)或SV-40转化细胞的核质、染色质和核基质，分析p53与这三种细胞核亚组分的关系时发现：在Meth-A细胞中，p53在代谢上变得稳定；在SV-40转化细胞中，p53与T抗原形成复合物后也显稳定，p53均与Meth-A和SV-40转化细胞染色质和核基质结合。进一步分析了p53与DNA相互作用的结果表明：mt(mutanttype)p53和wt(wildtype)p53以及重组后的杆状病毒在昆虫细胞中表达的wtp53均可与λDNA片段结合。p53与λDNA相互作用的特征提示：p53也应与核基质或MAR-DNA结合。根据以上结果，提出一种模型：p53通过与MAR元件结合并参与程序性的DNA复制和基因表达的调节。另外,wtp53和mtp53可能对复制区MAR-DNA结合产生不同的作用，它一方面抑制wtp53的活性,另一方面又引起了mtp53的活化。mtp53以类似wtp53蛋白的方式与MAR-DNA结合，但是这种mtp53缺乏与SV-40DNA的GGGCGG相同序列结合的能力。因此，p53突变并不影响DNA结合，而是有选择地干扰了它与个别DNA元件的结合。mtp53与MAR-DNA的结合具有特异性、高亲和性、和所涉及的MAR/SAR-DNA与mtp53的结合区域。mtp53的MAR/SAR(scaffoldattachregion)的结合区定位在两部分，高突变的核心区和C端的60个氨基酸残基部位，并带有非特异性DNA结合区和寡聚区。mtp53与MAR/SAR元件的相互作用可能干扰了核内的重要事件，因此产生了多效性的致癌作用。这种作用是因为MAR元件构成了染色质结构与功能的重要的更高层次的调节元件，以致改变肿瘤细胞的表型。或许，mtp53是一类新的癌基因的代表，它通过长距离地改变或干扰染色质结构和功能来发挥作用。2.2.2、pRbMancini等研究表明：一部分低磷酸化的pRb只是在G1早期与核基质结合，肿瘤细胞中的mtpRb却不能与核基质结合，而重组Rb的细胞含有大量的核基质结合的pRb蛋白；pRb广泛地分布在整个核基质内，尤其是浓集在核周和核仁残骸上，核基质的纤维颗粒上却检测不到pRb。他们筛选了潜在的pRb结合蛋白的表达文库，证明有几个克隆是核基质部分的，特别是核纤层蛋白LaminA和C在体外可与pRb结合。因此，他们提出，pRb与核基质的相互作用对它调节细胞周期进程的功能来说是重要的。与pRb蛋白羧基末端相互作用的多个细胞蛋白相反，DurfeeT等(1994)用双杂交系统筛选，仅分离到与氨基末端片段相关的一个克隆。这个基因编码一个新的核蛋白，其表观分子质量为84ku。与pRb相似，84ku核蛋白在检测的组织和整个细胞周期中均表达。实验还证明：84ku蛋白在亚核区域浓集，并参与RNA加工，与许多参与转录、拼接机制的蛋白相似，p84是一种核基质的成分。体内、体外的实验证明：p84优先和具有功能活性的低磷酸化形式的pRb结合。2.2.3、p21/WAF1LEC大鼠肝损伤与肝脏铜的异常累积有关。在LEC大鼠肝细胞中，p53和p21/WAF1的表达明显增高并显示较低生长活性。用低铜喂养LEC大鼠可明显地降低p53和p21/WAF1的表达；在用高铜喂养的大鼠肝细胞核和核基质做免疫印迹分析时发现：p21/WAF1蛋白在LEC大鼠肝的核基质中清