植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法)

实验三植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法)一、实验原理总RNA包括线粒体RNA、叶绿体RNA、tRNA和mRNA。与DNA一样，RNA在细胞中也是以与蛋白质结合的状态存在。RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%存在于细胞核内，15%在细胞器中。RNA以rRNA的数量最多(80-85%)，tRNA及核内小分子RNA占10%-15%，而mRNA分子只占1%-5%。mRNA分子大小不一，序列各异。RNA提取一般使用蛋白质强变性剂有效抑制RNA酶活性，同时并使DNA变性，再通过有机溶剂反复抽提去掉蛋白质、多糖等物质，在RNA沉淀剂的作用下，针对性分离出RNA。总RNA提取原则：①保持核酸结构的完整性；②排除其它分子的污染。二、仪器设备高速冷冻离心机、电子天平、冰箱三、材料及试剂1.材料：植物任何部分的新鲜组织2.试剂：①水饱和酚(pH4.9)；②苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合溶液；③3mol/LNaAc(pH5.2)；④RNA提取缓冲液：内含0.2mol/LTris-HCl(pH8.0)、0.4mol/LLiCl、25mmol/LEDTA和1%SDS；⑤2mol/LLiCl；⑥75％乙醇；⑦无水乙醇；⑧灭菌双蒸水(ddH2O，无Rnase)；⑨氯仿。四、操作步骤1．取取植物材料0.5g，放入预冷的研钵中，加入0.1ml-巯基乙醇。2．液氮中充分研磨，中间可补充液氮，直到将材料磨成粉末。3．将粉末迅速分装到3-5个1.5ml离心管中，分别加入0.6ml提取液，剧烈振荡2-3min。4．分别加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，振荡1min，冰上放置5min。5．4℃、12000g离心10min。6．将上层水相转到对应的灭菌离心管中，加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，振荡混匀，室温下、12000g离心5min。7．重复步骤6，直至无白色界面物质。8．将水相转至对应的灭菌离心管中，加入等体积氯仿振荡混匀，以除去痕量的苯酚。9．室温下、12000g离心5min。10．将上层水相转移至对应的灭菌离心管中，加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，混匀，-70℃放置30min。11．4℃、12000g离心20min。12．弃去上清夜，向沉淀加入0.3mlLiCl(2mol/L)，并振荡溶解，冰上静置10－30min。4℃、12000g离心20min。13．弃去上清液，加入0.3ml灭菌双蒸水(ddH2O，无RNase)，振荡使沉淀溶解。14．加入1/10体积的NaAc(3mol/L,pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，混匀，-70℃放置30min。15．4℃、12000g离心20min。16．弃去上清液，沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇1ml洗涤，并短暂离心。17．小心吸去残留的乙醇，空气中凉干3min。18．RNA用20-30l无菌水溶解，贮藏于-70℃备用。19．RNA的浓度测定和纯度分析取2-5lRNA溶液稀释至100l，于紫外核酸蛋白检测仪上测定A260、A280和A320的OD值，并计算RNA浓度和得率。注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm，对纯的RNA来说，OD260／OD280为2.0，1个OD260约为40g/mlRNA。20．RNA的完整性检测1.2%琼脂糖凝胶电泳在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带：28S、18S、和5SrRNA。其中28SrRNA条带的亮度应该为18SrRNA条带的1.5-2倍。反之，说明部分28SrRNA已经降解成18SrRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解；若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA污染。【注意事项】1．条件允许的实验室应专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用，RNA操作区应保持清洁，并定期行除菌。2．操作过程中应始终戴一次性手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具。3．避免在操作过程中说话聊天。4．配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶。5．所有旧塑料制品都必须用0.5mol/L的NaOH处理10min，用双蒸水彻底冲洗，DEPC-H20浸泡过夜后灭菌。6．所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下烘烤6h或更长时间。7．配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC在37℃处理12h以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。8.无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。但氯仿会溶解某些塑料制品，应当注意。9．有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。10.DEPC有致癌的潜在嫌疑，操作时要小心仔细，一定要戴上手套，并且最好在通风橱中进行。11．RNaseAwayTM试剂可以替代DEPC，操作简单，价格低，且无毒性。只需将RNaseAwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面，浸泡后用水冲洗去除，即可以快速去除器皿表面的RNase，并且不会残留而干扰后继实验。12．如果提取的RNA样品暂时不用，最好置于-70℃低温冰箱中保存，再次使用时应做RNA琼脂糖变性胶电泳分析，以检测RNA的完整性。【常用的RNA酶抑制剂】1.焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂(Rnasin)：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。