毛囊组织DNA提取方法的研究

药物性耳聋线粒体12SrRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系1人头发毛囊组织DNA提取方法的研究技术保障与研发部魏宏泉摘要本研究以人头发的毛囊组织为材料，在动物组织总DNA提取的经典技术方案基础上，兼顾效率、成本和产率等三方面因素，对毛囊组织DNA提取方法进行了优化，并设计了实用有效的取样方法。研究结果显示，可以以少至一根带毛囊的头发为材料，在40分钟时间内获得约0.5g组织DNA，其产量和质量可以满足基因检测工作后续流程的需要。同时，一次提取过程所耗药品试剂的成本约为0.3元，大大低于以微量血为材料的试剂盒提取法的成本。在以RFLP法对线粒体12srRNA基因1555位点进行基因检测的技术体系中，组织DNA提取是实验室工作的第一步，该工作的效率、质量、成本等因素对整体检测流程具有至关重要的影响。在此之前的研究工作中，我们确定了以微量血为材料提取组织DNA的技术方法，但为了使基因检测项目的实施具有更强的可操作性，设计多样化的组织样本采集形式则是必需的。为此，本研究以人头发毛囊组织为材料，旨在建立适用的取样方法和DNA提取方法的技术体系。1.材料与方法人头发毛囊组织取自健康成年人。取样方法：用镊子夹住头发根部的部位，顺着毛发生长方向用力一拔即可，此时在毛发根部应明显可见白色或半透明的毛囊组织。然后用剪刀剪去大部分的毛干部分，将毛根带有毛囊组织的部分置于1.5mlEppendorf管内。试剂配制（1）ProteinaseKProteinaseK用去离子水溶解，浓度20mg/ml。（2）组织消化液10mMTris-HCl，pH7.510mMEDTA10mMNaCl0.5％SDS（3）LiCl溶液无水LiCl用去离子水溶解，浓度为7.5M。（4）TE溶液10mMTris-HCl，pH7.50.1mMEDTA，pH8.0参考操作程序（1）加入60l消化液，再加入1l蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。（2）于55℃水浴2小时。药物性耳聋线粒体12SrRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系2（3）加入60lLiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。（4）13000rpm离心15分钟，将上清移入一个新的离心管中。（5）加入240l无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。（6）13000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。（7）13000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。（8）加入20lTE缓冲液溶解DNA。（9）用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。头发数量对DNA提取结果的影响将拔取的头发分为6组，分别为1、2、3、4、5、6根头发，按1.3中的参考操作程序进行操作，提取DNA并用电泳检测结果。蛋白酶K消化对DNA提取结果的影响（1）将拔取的头发分为4组，每组1根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55℃水浴时间分别为15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。（2）将拔取的头发分为6组，每组2根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55℃水浴时间分别为0分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。（3）将拔取的头发分为6组，每组2根，其中5组在操作程序中加入的蛋白酶K浓度分别为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml，最后一组不加蛋白酶K，其余步骤按参考操作程序进行。（4）将拔取的头发分为5组，每组1根，在操作程序中不进行加入蛋白酶K及水浴步骤，其余步骤按参考操作程序进行。优化操作程序的多样本比较实验以五个人为对象，各拔取两根头发作为样本分为两组，每组一根头发，共计10组，以下列操作程序提取DNA：（1）加入60l消化液，再加入1l蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。（2）于55℃水浴10分钟。（3）加入60lLiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。（4）13000rpm离心10分钟，将上清移入一个新的离心管中。（5）加入240l无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。（6）13000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。（7）13000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。（8）加入20lTE缓冲液溶解DNA。（9）用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。（10）各取2lDNA溶液作为模板进行PCR，PCR反应体系及程序设置按照“药物性耳聋易感基因检测的RFLP标准操作程序”进行。2.结果与分析药物性耳聋线粒体12SrRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系32.1头发数量对DNA提取结果的影响以1-6根头发为材料，每组都可以有效提取出基因组DNA，1-3根头发组的DNA产量有较为明显的随头发数增多而产量也增多的变化，3-6根头发组的DNA产量则没有明显差别。如图1所示。在图1显示的电泳结果中，第1、2、3条带的亮度逐渐增加，说明随着头发数的增加其相应的DNA产量也随之增加，而第3、4、5、6条带的亮度差异不明显，说明所获得的DNA产量基本相同注1。而事实上1-6根头发中所含DNA的量应该是随头发数量增加而递增的，出现这种矛盾现象的可能原因是：相同的消化液和蛋白酶K使用量并不适用于处理不同数量头发。在本实验中，所使用的60l消化液和1l蛋白酶K可能是对应于1-3根头发的合适用量，可以达到完全裂解细胞膜和细胞核并释放DNA的效果，而4-6根头发可能造成了蛋白酶反应底物的过量，这些过量的组织细胞并没有被裂解，因此所释放出的总DNA量仍与1-3根头发释放的DNA量相当。从电泳结果显示的条带亮度来看，由于所使用的DNA分子量标准每条带的亮度约为20ng，因此可以估测认为，本实验从一根头发中提取出的基因组DNA约为400-600ng，该产量对于基因检测的技术实施来说已经足够，完全可以满足后续工作的需要。2.2蛋白酶K消化对DNA提取结果的影响在蛋白酶K反应体系中，组织样本中细胞的裂解率是受酶促反应时间和酶与底物比例影响的。本实验中各组均以一根头发为材料提取DNA，同时所使用的蛋白酶K适度过量，结果DNA产量出现了随时间而变化的梯度上升。（1）蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响。注1：DNA条带的亮度差异包含因不同样本的毛囊大小不同而导致的DNA产量差异这一因素，本研究中对此差异忽略不计。本研究中各实验都存在此现象，在此一并说明，后文不再一一注解。Lane1：一根头发提取DNA的结果Lane2：二根头发提取DNA的结果Lane3：三根头发提取DNA的结果Lane4：四根头发提取DNA的结果Lane5：五根头发提取DNA的结果Lane6：六根头发提取DNA的结果LaneM：MWmarkerDL2000(20ng/band)123456M2000bp图1头发数量对DNA提取结果的影响Lane1：水浴15分钟所提取的DNALane2：水浴30分钟所提取的DNALane3：水浴45分钟所提取的DNALane4：水浴60分钟所提取的DNALaneM：MWmarkerDL2000(20ng/band)1234M2000bp药物性耳聋线粒体12SrRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系4从图2可以看出，蛋白酶K消化时间与DNA产量之间的对应关系是：在30分钟之内，细胞裂解率与消化时间成正比，而超过30分钟之后，DNA产量不再增加。产生这一现象的原因可能是：在60l消化反应体系中加入1l蛋白酶K已经达到过量的水平，虽然参考程序中建议消化2小时，但本反应体系在反应进行到30分钟时已经将组织细胞全部裂解。进一步的计算结果表明，该反应体系中蛋白酶K的实际工作浓度为333ng/l，而哺乳动物组织DNA提取的经典技术方案中推荐的蛋白酶K工作浓度一般是100ng/l，本实验中蛋白酶K过量2.3倍，因此，原本应该会产生的随消化时间（30-60分钟时间段）而变化的DNA释放效率因酶的过量而被弥补了。在图3中可以看出，在进一步的实验结果中也显示了同样的现象：即10-30分钟时，细胞裂解率与消化时间成正比，而超过30分钟之后，DNA产量不再增加。同时我们也可以看到，不进行水浴是无法得到DNA产物的，这也进一步说明了蛋白酶K在消化液成分中的重要性，以及适宜温度对酶促反应的重要性。（2）蛋白酶K用量对DNA提取结果的影响图2蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响（1）Lane1-2：未进行水浴所提取的DNALane3-4：水浴10分钟所提取的DNALane5-6：水浴20分钟提取的DNALane7-8：水浴30分钟提取的DNALane9-10：水浴60分钟提取的DNALaneM：MWmarkerDL2000(20ng/band)12345678910M图3蛋白酶K消化时间对DNA提取结果的影响（2）2000bpLane1-2：20mg/ml蛋白酶K组Lane3-4：10mg/ml蛋白酶K组Lane5-6：5mg/ml蛋白酶K组Lane7-8：2.5mg/ml蛋白酶K组Lane9-10：1.25mg/ml蛋白酶K组Lane11-12：无蛋白酶K组LaneM：MWmarkerDL2000(20ng/band)123456789101112M图4蛋白酶K用量对DNA提取结果的影响（1）2000bpLane1-5：无蛋白酶K的平行实验组LaneM：MWmarkerDL2000(20ng/band)12345M图5蛋白酶K用量对DNA提取结果的影响（2）2000bp药物性耳聋线粒体12SrRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系5如图4所示，当使用的蛋白酶K的浓度为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml时，DNA产量大致相当，其中5mg/ml组较其它两组为少。当使用的蛋白酶K的浓度为2.5mg/ml、1.25mg/ml时，DNA产量较前三组明显减少。无蛋白酶组中只有一个样本有少量DNA产物。将使用的蛋白酶K用量换算成终浓度，则各组中蛋白酶K的工作浓度分别为333.3ng/l、166.7ng/l、83.3ng/l、41.6ng/l、20.8ng/l，如果以100ng/l做为反应体系中蛋白酶K的标准工作浓度，可以在发现2.5mg/ml组和1.25mg/ml组中，蛋白酶K用量显然不足，因此DNA产量较前三组明显减少。图5显示的是无蛋白酶K及其55℃水浴步骤时DNA提取的结果。将这一结果和图4显示的结果相比较，我们可以发现消化液与蛋白酶K在释放DNA过程中有效反应条件的差异：当无蛋白酶K参与反应时，55℃水浴处理可以增强消化液的作用效果，其结果是也可以释放部分DNA，但如果减去了水浴处理步骤，在室温条件下，消化液则不能起到有效释放DNA的作用。参照图3显示的酶促反应条件结果，即便消化液与蛋白酶K同时存在，如果不进行55℃水浴处理仍然不能起到应有的作用。这些实验结果说明，基本消化液成分对于蛋白酶K功能实现是必需的，同时适宜温度也是必要条件之一。这一结论与传统生物化学相关理论的论述是相符合的。2.3优化操作程序的多样本比较实验本研究设计的操作程序应用于来自不同个体的样本时，DNA产量的差异很显著，在10个样本中，有4个样本的提取物在进行电泳检测时不可见，并且其中的两个样本当以其DNA作为模板进行PCR时也未出现扩增产物。如图6、7所示。Lane1-2：从样本1中提取的DNALane3-4：从样本2中提取的DNALane5-6：从样本3中提取的DNALane7-8：从样本4中提取的DNALane9-10：从样本5中提取的DNALaneM：MWmarkerDL2000(20ng/band)12345678910M图6对不同样本进行DNA提取的结果2000bpLane1-2：样本1DNA产物为模板的PCR结果Lane3-4：样本2DNA产物为模板的PCR结果Lane5-6：样本3DNA产物为模板的PCR结果Lane7-8：样本4DNA产物为模板的PCR结果Lane9-10：样本5DNA产物为模板的PCR结果L