水微生物学实验指导书

水微生物学实验指导书武汉科技大学城市建设学院给排水工程系2007.121目录页实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察活性污泥生物相的观察实验二培养基的制备及灭菌微生物的纯种分离及计数实验三微生物生理生化特性2实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察一、实验目的1.了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养方法。2.观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。二.实验内容1．显微镜的使用方法和保养方法2．微生物形态的观察三、实验仪器、设备及材料1.光学显微镜、载玻片、盖玻片等2.示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。四、实验原理显微镜的结构和各部分的作用图1是微生物实验常用的双目电光源生物显微镜，其构造分机械和光学两部分：机械部分主要包括：1．镜筒镜筒是双筒，两筒间距离可调，长度一般是160mm。它的上端装有接目镜，下端有回转板。回转板上一般装有3个接物镜。2．载物台载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。3．调节器镜臂旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降载物台，调节接物镜与所需观察的物体之间的距离。光学部分主要包括：1．接目镜一股使用的显微镜具有2—3种放大倍数的接目镜，其上常刻有“5×”、“10×”或“16×”等数字及符号。意即使用时可放大5倍、10倍或16倍。观察微生物时常用放大10倍或16倍的接目镜。2．接物镜接物镜装在回转板上．可分低倍镜、高倍镜和油镜3种，其相应的放大倍数常是10、40(45)、100。通常显微镜的放大倍数等于接物镜与接目镜放大倍数的乘积。例如：用放大40倍的接物镜(高倍镜)与放大10倍的接目镜时所得的物象的放大倍数为40×10＝400。如果用放大100倍的接物镜则放大倍数为100×10＝1000。接目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，所以通常所谓的用低倍镜、高倍镜或油镜的观察主要是指使用不同的接物镜而言的。油镜的放大倍数最大(100)。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短．直径就很小。所以自标本玻片透过的光线，因介质密度(从玻片至空气，再进入油镜)不同、有些光线因折射或全反射，就不能进入镜头，致使射入的光线较少，物象显现不清。所3以为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片中间加入和玻璃折射率(M＝1.52)相仿的镜油(香柏油M＝1.5l5)。因为这种接物镜使用时须加镜油，所以我们称它为油镜。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油，所以也称之为干镜。3．聚光器聚光器在载物台的下面，用来集合由光源过来的光线。聚光器可以上下调整，中央装有光圈。用以调节光线的强弱。当光线过强时．应缩小光圈或把聚光器向下移动。4．光源光源装在显微镜的最下方，带有开关，其光亮也可调节。五、实验步骤(一)显微镜使用和保护的方法1．低倍镜的使用法(1)置显微镜于固定的桌几上，接上电源，打开开关，调节合适光量。(2)拨动回转板，把低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒连接而对直。(3)两眼向接目镜里观察，同时调节两目镜镜筒间的距离，使两接目镜中的视野重合。(4)把载玻片放到载物台上，要观察的标本放到园孔的正中央。(5)将粗调节器向上旋转，同时眼睛注视接物镜，以防接物镜和载玻片相碰。镜头的尖端距载玻片约5mm时即停止旋转。(6)两眼向接目镜里观察，同时把粗调节器向下旋转。如标本显出，但不十分清楚，可用细调节器调节，至标本完全清晰为止。(7)假如因旋转粗调节器太快，致使超过焦点，标本不能出现时，不应在眼睛注视接目镜的同时向上旋转粗调节器，必须从第(5)步作起，以防因没有把握的旋转，使接物镜与载玻片碰触，造成损坏。(8)在观察时，两眼都要同时睁开。2．高倍镜的使用法(1)使用高倍镜以前，先用低倍镜检查，在用低倍镜找到观察目标后，若需要进一步放大观察，将目标移到视野中央。(2)拨动回转板使高倍和低倍两镜头互相对换。当高倍镜移动到载玻片时，往往镜头十分靠近载玻片。这时必须注意是否因高倍镜靠近的缘故而使载破片也随着移动。如果载玻片有移动的现象，则应立刻停止推动回转板。把高倍镜退回原处，再按照使用低倍镜的方法，重新校正标本的位置。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光量调大一点。(3)当高倍镜已被推到镜筒下面时，向镜内观察所显现的标本，往往不很清楚，这时可旋转细调节器使之清晰，上下移动，但不要过分移动。（此时不再动粗调）图243．油镜的使用法(1)如用高倍镜放大，倍数还不够大则须采用油镜。用油镜以前，先用低、高倍镜检查。把要观察的标本移到视野正中。(2)用油镜时，在载玻片标本上加几滴镜油，然后拨动回转板对换高倍镜和油镜，使油镜头尖端和油接触，而后向接目镜观察。假如不清晰，可稍微转动细调节器，但切记不要用粗调节器。(3)用过油镜后，必须用擦镜纸或软绸将载玻片和油镜所粘着的油拭净，略蘸擦镜液少许，揩拭镜头，最后用擦镜纸或软绸擦干。4．显微镜的保护法(1)显微镜应放置在干燥的地方，使用时须避免强烈的日光照射。(2)将载物台降至最低，取下标本片。将光量调至最小，关上电源。(3)接物镜或接目镜不清洁时，应当用擦镜纸或软绸揩擦。(4)用完显微镜后，应当立即放到镜匣中。（二）微生物形态的观察1.用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。2.画出微生物形态图，并标明显微镜的放大倍数及微生物的名称。六、实验报告要求1．分别绘出你在低倍镜、高倍镜、油镜下观察到的颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌等的形态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大倍数。2．做思考题（详见八、思考题）七、实验注意事项1．取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；使用显微镜时应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。2．在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。3．切忌用手或其它纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。八、思考题1．使用显微镜时，哪些地方须特别注意?2．使用低倍镜时，显微镜的放大倍数一般最大可达多少?使用高倍镜时显微镜的放大倍数是怎样呢?在什么时候才需要使用油镜?5活性污泥生物相及藻类形态的观察一、实验目的1.学习测量微生物大小。2.学习用压滴法制作标本片。3.观察几种原、后生动物，菌胶团及藻类个体形态二、实验内容1.目测微尺和物测微尺及其使用的方法2．标本的制备3．显微镜观察三、实验仪器、设备及材料1.活性污泥混合液。2.单胞藻、新月藻、草履虫等示范片。3.显微镜、载玻片、盖玻片。4.目测微尺、物测微尺。四、实验原理1．目测微尺目测微尺是一圆形玻片，其中央刻有精确的刻度(图3)，等分为100格或更多格。标尺刻度的大小，随使用的接目镜和接物镜放大倍数以及镜筒的长度而改变。2．物测微尺物测微尺系一厚玻片，中央有一微小圆圈，圆圈里有100等分刻度标尺，每等分的长度为1／100mm，即10μm／格。五、实验步骤1.目测微尺和物测微尺的使用方法目测微尺使用前，应先利用物测微尺进行标定。物测微尺使用时，先将目测微尺装入接目镜的隔板上，使刻度朝下；把物测微尺放在载物台上，使刻度朝上，用平常观察标本的方法，先用低倍镜找到物测微尺的刻度，再移动物测微尺与目测微尺使两者的第一线相合，然后计算物测微尺的每一小格内目镜测微尺图3物测微尺6有目测微尺的小格若干个，于是计算后者刻度所表示的长度。如物测微尺的一小格相当于5个目测微尺的小格，则目测微尺在此种条件下，其每格的长度即等于2μm。如在同样条件下测量物体，而物体之长度为目测微尺的两小格，宽为半小格，则可知此物体的大小为1μm×4μm。换高倍镜用同样方法标定出高倍镜下目测微尺每格的长度。2．标本的制备1)取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片的中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后，取沉淀污泥一小滴于载破片上；如混合液中污泥较多．则应稀释后进行观察)。2)小心地用洗净的盖玻片覆盖。这样，就制成了活性污泥的标本。加盖玻片时应使其中央已接触到水滴后才放下，否则会在片内形成气泡而影响观察。3．显微镜观察(1)低倍镜观察1)在选定的接目镜下，利用低倍镜，确定目测微尺一格的长度(单位以μm计)。2)观察所制备的微生物标本玻片，画出所见原生动物、菌胶团等微生物的形态草图。选择一个原生动物，量出其尺寸。3)记下观察所用接目镜和接物镜的放大倍数，算出显微镜的放大倍数。(2)高倍镜观察1)改用高倍镜观察，利用高倍镜，确定目测微尺一格的长度(单位以μm计)。画出微生物的形态草图并与用低倍镜所看到的比较，注意其不同点。2)记下显微镜的放大倍数。3)观察几种藻类的个体形态，画出生物形态图，标明名称、放大倍数。六、实验报告要求1．描述所见藻类、原生动物、菌胶团等微生物的形态特征，画出草图。选择一个原生动物，量出其尺寸。2．做思考题（详见八、思考题）七、实验注意事项1．观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分小心，防止接物镜压坏镜台微尺和损坏镜台。八、思考题1．为什么目测微尺必须用物测微尺标定?在某一放大倍数下，标定了目测微尺，如果放大倍数改变，它还需重新标定否?7实验二培养基的制备及灭菌本次实验可为下次实验作准备。实验内容主要包括玻璃器皿的洗刷、包装和培养基的制备以及灭菌技术等。在作微生物学实验时，所用培养基及玻璃器皿等均须进行灭菌。一.目的1．学会玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。2．掌握培养基配制和无菌水制备的方法。3.学会干热灭菌和高压蒸汽灭菌技术。二.实验器材1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。2.牛皮纸等包扎材料。3.10%HCl、10%NaOH、精密pH试纸。4.牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂。5.高压蒸汽灭菌锅等。三、实验内容(一)玻璃器皿的洗刷与包装1．洗刷玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。培养皿、试管、锥形瓶等可以用去污粉或肥皂洗刷，然后用自来水冲洗。吸管则先用洗液浸泡，再用水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿应放在烘箱里烘干。2．包装(1)培养皿由一底一盖组成一套。按实验所需的套数一起用牛皮纸包装。(2)吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成1~1.5cm长的棉塞。以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的吸管的尖端。放在4~5cm宽的长纸条的一端，吸管与纸条约成350交角，折叠包装纸包住尖端，用左手将吸管压紧，在桌面上向前搓转，纸条即螺旋式地包在管子外面，余下纸头折叠打结，按照实验需要，可单支包装或多支包装，以备灭菌。3.干热灭菌上述玻璃器皿在160℃烘箱内加热2小时。(二)培养基的制备营养琼脂培养基(肉膏、蛋白胨、琼脂培养基)是一种固体培养基。本实验制备后可供活性污泥纯种分离和细菌总数测定之用。1.细菌培养基成分牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂自来水0.75g2.0g1.0g4.0g200ml82.步骤(1)配制溶液按培养基的配方，称取各种原料。取适量的烧杯盛所需水量，依次将各种原料加入、溶解。难溶的原料如蛋白胨、牛肉膏、琼脂等需加热溶解。这时，当原料全部溶解后应加水补充因蒸发损失的水量。加热时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。(2)调整pH值用精密PH试纸(或pH电位汁或氢离子浓度比色计)测定培养基溶液的pH值。按要求以10％HCl或10％NaOH调整至7.5左右。(3)过滤用纱布、滤纸或棉花过滤均可。如培养基内杂质很少，可省略过滤。(4)分装将培养基分装在试管和锥形瓶内。要使培养基直接流入管内或瓶内。注意防止沾污上段管壁或瓶壁，并避免浸湿棉塞。装入试管或锥形瓶的培养基量，视试管或瓶子的大小及需要而定。一般制备斜面培养基时，每支试管装入的量约为试管高度的l/4~1/5。（5）加塞包扎：试管加硅胶塞、锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。（6）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）：1.05kg/cm2(103kPa)