抗氧化体内的评价方法

抗氧化体内的评价方法张丽楠天津科技大学生物工程学院，天津300457摘要：抗氧化是抵抗集体氧化作用的过程，目前准确评价生物活性物质的抗氧化能力已经成了氧化与抗氧化研究领域的热点问题，为了更好地评价样品的抗氧化性，常用的评价方法分为体内和体外评价方法，本文主要介绍几种体内的评价方法。关键词：抗氧化性；体内测定方法EvaluationoftheantioxidantinthebodyZhanglinanBiologicalEngineering,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457Abstract:Anti-oxidationistheprocessofcollectiveresistancetooxidation,antioxidantcapacitycurrentlyaccurateevaluationofbioactivesubstanceshavebecomeoxidizedandantioxidantresearchinthefieldofhotissues,inordertobetterevaluatetheantioxidantactivityofthesample,thecommonlyusedevaluationmethodsintoinvivoandinvitroevaluationmethods,thispaperdescribesseveralmethodsevaluatedinvivo.Keywords:antioxidantactivity:Determinationofinvivomethods抗氧化是抵抗集体氧化作用的过程，也是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。越来越多的研究显示抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能。因此，当生物体内产生了大量的自由基，平衡被破坏时，生物体就会生病，这样需氧生物在不断进化过程中，逐渐形成了一套完整的抗氧化系统。基于不同原理的各种抗氧化活性检测方法已广泛用于抗氧化活性物质，这些方法虽然能够在不同的条件下反映抗氧化活性物质的多种功能特性，但也各有其局限性，目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于以下机理：（1）样品对检测体系中脂类物质的氧化抑制能力反映被测物的抗氧化活性；（2）样品对检测体系中自由基的清除能力反映被测物的抗氧化活性；（3）测定样品的还原能力反映被测物的抗氧化活性。[1]很据以上机理，抗氧化活性物质的检测方法分为体内评价方法和体外评价方法，本文针对当前该领域的发出状况，在总结前人的科研成果的基础上，简单的介绍几种体内评价方法。1体内抗氧化防御系统需氧生物在不断进化过程中，逐渐形成了一套完整的抗氧化系统，包括预防性的、阻断性的和修复性的，也即一级和二级抗氧化防御系统；分别在不同水平发挥着防御作用。一级抗氧化防御系统也称为初级抗氧化防御系统，分为抗氧化酶和非酶性抗氧化剂。能够是自由基失效的化学物质称为“抗氧化剂或抗氧化酶”。抗氧化剂或抗氧化酶是清除氧自由基或阻止、抑制氧自由基产生过氧化物的物质。抗氧化酶系统包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转硫酶、髓过氧化物酶、细胞色素C过氧化物抗坏血酸过氧化物酶等。抗氧化非酶系统，也即抗氧化剂，包括两大类，一类是人体必需的抗氧化剂，包括维生素E、维生素C、类胡萝卜素、锌、硒、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、铜蓝蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等；另一类是人类非必需的抗氧化剂，如生物类黄酮、花色素、番茄红素和叶黄素等。脂质、蛋白质和核酸是氧自由基攻击的主要靶点。在正常情况下，虽然初级抗氧化防御系统通过各种抗氧化剂和抗氧化酶能有效地防止活性氧对靶分子的作用，但是由于细胞能不断地生成氧自由基，特别是在病理条件下以及衰老时活性氧的生成量大大增加，生成的活性氧特别是活性羰基超过了细胞抗氧化防御能力，由此引起蛋白质和DNA的氧化损伤。为了对受损的蛋白质和DNA进行修复，机体形成了二级抗氧化防御系统，即所谓的抗氧化修复系统。抗氧化修复酶如谷胱甘肽还原酶、蛋氨酸硫氧化物还原酶A等，在机体抗氧化损伤方面也起着重要作用，二级抗氧化防御系统的作用机制。2体内抗氧化能力检测方法体内抗氧化能力评价主要借助氧化应激生物标志物的测定来判断生物活性物质对DNA氧化损伤、脂质过氧化、蛋白质氧化损伤、线粒体氧化损伤的保护程度，以及直接测定抗氧化防御系统抗氧化水平。2.1DNA氧化损伤检测方法DNA氧化损伤是细胞凋亡的开始。通过细胞以外的因素或细胞内的新陈代谢都可以产生活性氧ROS，活性氧（ROS）能损伤多糖类、脂质、蛋白质、DNA等多种生物大分子，会引发心血管疾病或神经系统疾病，至少两种老年疾病和癌症被证明是由活性氧ROS损伤DNA诱发的。活性氧ROS损伤DNA，破坏机体正常的生理过程。目前对DNA氧化损伤的检测可分为直接和间接两方面的检测，直接检测DNA损伤比较常用的方法是测量DNA单链断裂，即单细胞凝胶电泳法（SCGE）与质粒氧化损伤。间接检测DNA氧化损伤较常用的指标是测定血清与尿中8-羟基脱氧鸟苷，正常情况下，8-羟基脱氧鸟苷在DNA修复机制的作用下被及时切除，形成8-羟基脱氧鸟苷随尿液排出体外。所以血清与尿中8-OH-dG可作为DNA氧化性损伤的分子生物学标记物。另外使用电化学法研究抗氧化剂与DNA之间的作用也很重要，可以从另一个角度解释抗氧化剂的作用机理。[2]2.2蛋白质氧化损伤蛋白质的氧化损伤不仅包括对酶、受体和载体蛋白的损伤,而且还包括一些二次损伤,如:DNA修复酶的损伤。目前,蛋白质氧化使用最广的生物标志物是蛋白质羰基含量(ProteinCarbonylContent,PCC),其传统的检测技术是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶联免疫吸附法(ELISA)测定2,4-二硝基苯肼与蛋白质羰基反应生成的腙,来衡量蛋白质的损伤情况。PCC法是快速的检测方法,不需要特殊、昂贵的设备。然而,蛋白质羰基含量并不是氧化应激的特异性生物标志物,而只是总体的粗略衡量。蛋白质特异性的氧化应激标志物是3-硝基络氨酸,但是,3-硝基络氨酸的测定方法耗费时间,而且与PCC相比它需要比较精密的分析设备。[2]2.3线粒体氧化损伤在细胞内绝大多数氧分子是被线粒体内膜呼吸链蛋白酶消耗的，在呼吸链上产生的过氧化物，在一定条件下，会转变为过氧化氢，进而成为羟基自由基，使超氧歧化酶功能紊乱或者使线粒体的呼吸链紊乱。会导致线粒体DNA（mtDNA）基因突变或者染色体端粒加速变短，从而影响人的寿命。自由基可以产生于线粒体内并经常释放到胞浆。线粒体中ATP的生产涉及到通过电子传递链上的质子在内膜运输。最后的电子受体会消耗氧气分子，通常是生成了水分子，但在一个小又意义重大的百分比之内（1%～2%），超氧阴离子会产生。超氧阴离子会从线粒体带走额外电子，这会对mtDNA、线粒体膜、蛋白质造成损害。如果造成太大的损失，细胞会发生凋亡。细胞凋亡和线粒体外膜的表面蛋白Bcl-2有关。自由基衰老学说指出，当线粒体由于自由基损伤，造成能量损失，细胞就会进入凋亡阶段。由于线粒体膜易受过氧化物的攻击，所以针对保护线粒体的抗氧化活性检测可以采用脂质过氧化检测方法。实验中必须精确分离线粒体膜，保证膜功能完整，尽量模拟出在细胞内的真实情况[2]2.4脂质氧化损伤硫代巴比妥酸法(TBARS),是最早用于人类与动物抗氧化研究,反映脂质氧化损伤的方法。最初的TBARS法相对简单,缺乏特异性,相对陈旧。而改进后的TBARS法由于使用了高效液相色谱法(HPLC),敏感度、特异度和重复性都明显提高了。呼吸烃类的测定,也是一种被广泛使用的、非侵入性的体内评价脂质过氧化的方法。只是由于在呼气收集、处理和分析中缺乏标准化方法,导致了结果的不稳定性。氧化型的低密度脂蛋白(LDL),已被公认是氧化应激防御的生物标志物;F-异前列烷是由自由基诱发花生四烯酸反应,之后在磷脂中生成的又一新的氧化应激生物标志物。3讨论体内实验法接近生物体实际体系,而且比较灵敏,但周期长、成本大且实验繁琐，因此有其自身的局限性。因此,在进行生物活性物质抗氧化能力评价的时候,为了保证评价结果的真实性与可靠性,应该遵从由体外到体内,由化学环境到生物环境逐级深入的原则。在保证体外评价结果可靠的基础上,进行体内评价的动物实验,并在保证动物实验从设计到干预、最后结果科学性的基础上,再进一步人群实验,这是评价的最终阶段。但是,在开展体内评价的时候,一定要注意到所评价物质的毒性和剂量反应。[3]实验以动物为模型，对其饲喂受试物，利用生化手段对其各项相关的生理指标进行测定，通过实验组与空白组各项指标的比较评价受试物在生物体内的抗氧化活性。常见实验方法如下：选用清洁级大鼠或小鼠为对象，用受试物按实验研究计量及时间连续饲喂，完成后处死动物，根据实验目的取其血液或组织器官，测定其中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）及过氧化氢酶（CAT）等指标，同空白对照组比较，从而得出受试物在生物体内的抗氧化能力。除采用健康动物测试外，体内实验还多采用人为制造的疾病动物为模型，研究天然产物对某一靶向疾病或组织的作用。[4]总之，理想的抗氧化活性评价方法应具有以下特点：①原理明确；②操作简单；③可反映物质对绝大多数自由基的抑制或清除能力；④生物相关性良好参考文献[1]刘志东，郭本恒，王荫榆.抗氧化活性检测方法的研究进展[J].天然药物研究与开发，2008,20:563-567.[2]张明，冯璐璐.抗氧化活性评价标准与发展[J].安徽农学通报，2010,16（08）:33-34.[3]刘小兵，朴建华.营养与食品安全[J].中国食品卫生杂志，2008,20(5):440-443.[4]曾维才，石碧.天然药物抗氧化活性的评价的常见评价方法[J].2013,32（6）:1205-1213.