抗氧化研究

羟基自由基清除率的测定测定方法采用Fenton反应[9-10]参照史亚男等[11]学者的方法，并略作改进取1mL0.75mmol/L的邻二氮菲溶液（无水乙醇配制），加2mL0.2mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.4），充分混匀后加入1mL0.75mmol/L的硫酸亚铁溶液（去离子水配制），每加一管立即混匀，加入1mL浓度为0.10.20.40.60.81.0mg/mL的样品溶液，最后加入1mL0.01%H2O2，于37℃保温1h，536nm处测定吸光度为A处理，将体系中的样品改为加入1mL蒸馏水，测定得A对照。空白对照不加0.01%H2O2，以蒸馏水补充体积，测定得A空白对照每个质量浓度样品做3个平行样品，取平均值羟基自由基的清除率计算公式如下：清除率（%）=（A536处理-A536对照）/（A536空白对照-A536对照）*100DPPH清除率的测定[12-13]称取一定量的，分别用无水乙醇配成浓度为5、10、20、40、60、80、100mg/mL，取2mL样品溶液，加入2mL0.2mmol/mL的DPPH溶液，摇匀，于25℃水浴中加热15min后，以无水乙醇调零，测定517nm处的吸光值Ai；取2mL无水乙醇代替样品溶液测得空白吸光度A0；以2mL样品溶液中加入2mL无水乙醇，测得样品本体吸光度Aj同一测定重复3次，取平均值按下式计算清除率：清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）/A0]*100Fe3+还原实验配制浓度为0．03mol/L的铁氰化钾溶液和pH为6．6的磷酸盐缓冲溶液样品组:1mL样品+1.25mL缓冲液+1.25mL铁氰化钾溶液，记为AS;对照组:1mL甲醇+1.25mL缓冲液+1.25mL铁氰化钾溶液，记为AC;阳性对照组:1mLTrolox+1．25mL缓冲液+1.25mL铁氰化钾溶液，同记为AS各组于50℃恒温反应30min，冷却后加入1．25mL10%的三氯乙酸溶液，在4000×g离心力下离心10min，取上清液1．25mL，并向其中依次加入1．25mL蒸馏水0．25mL0．1%的三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定吸光度(用蒸馏水调零)超氧阴离子清除活性：空白管：3mLTris-HCL+0.5mLTris-HCL+0.5mLNBT+0.5mLPMS对照管：3mLTris-HCL+0.5mLNADH+0.5mLNBT+0.5mLPMS样品管：3mL样品+0.5mLNADH+0.5mLNBT+0.5mLPMS以上样品依次加入各试剂，摇匀后放置5min，在560nm测定吸光度。其中Tris-HCL浓度16mM,pH=8.0，NADH浓度300µM，NBT浓度468µM，PMS浓度60µM。所有试剂及样品均用上述Tris-HCL溶解配制。清除率=1-A样品/A对照羟自由基清除活性空白管：1mL水+0.5mLEDTA-Fe+1mLPBS+1mL番红花+1mL双氧水对照管：1mL水+0.5mLEDTA-Fe+1mLPBS+1mL番红花+1mLPBS样品管：1mL样品+0.5mLEDTA-Fe+1mLPBS+1mL番红花+1mL双氧水加完后摇匀在37˚C水浴反应30min，520nm测定吸光度。其中PBS缓冲液（150mM,pH=7.4）,番红花(360µg/mL）,H2O2（3%）,EDTA-Fe(2mM)。EDTA-Fe和样品需要水溶，其余用PBS溶解。清除率=A样品/A对照还原能力：1mL样品加1mL铁氰化钾后在50˚C反应20min，再加2mL三氯乙酸，5min后加1.2mL三氯化铁。静置30min后700nm测定吸光度。直接以吸光度做曲线即为还原能力，吸光度越大，还原能力越大。溶剂为磷酸缓冲液（0.2M，PH=6.6），铁氰化钾（1%），三氯乙酸（10%），三氯化铁（0.1%）。除三氯化铁和样品以水配制外，其余加磷酸缓冲液配制。在2.5mLpH=6.6磷酸缓冲液中加入1mL待测液和1mL1%铁氰化钾溶液,混合均匀后将混合物在50℃恒温条件下加热20min后,急速冷却,加入2.5mL10%三氯乙酸,3000r/min离心分离10min。取上层清液5mL,依次加入5mL水和1mL0.1%氯化铁溶液,混合均匀,静置10min后在波长700nm下测定吸光值（A）。A值越大,则样品的还原力越强。DPPH清除能力：样品3mL加DPPH1mL后暗处放置20-30min后在517nm出测定吸光度。溶剂为40%甲醇溶液，DPPH以40%甲醇溶解为0.1mM溶液。对照为3mL甲醇+1mLDPPH。清除率=1-A样品/A对照