抗细菌转基因工程课程资料.

主讲人：李立志第三小组成员:李立志、李小强、李瑜水稻细条病的发现•水稻细菌性条斑病(简称细条病)由XanthomonascamPestrispv.Oryzicola（简称Xoc）引起。•最早在1918年由Reinking首次报道了菲律宾水稻上发生细条病,在我国范怀忠等(1957)于20世纪50年代在广东省首先发现该病害。开始时误认为是白叶姑病，后经方中达等(1957)将该病与白叶枯病区分开来’确认为一种新的由细菌性病害。病菌特点•该病菌属黄单胞杆菌属细菌,生长最适温28-30°C。低于16°C基本不发病。细条病的发生初侵染源主要有稻种、稻草和自生稻带菌,但也不排除野生稻、李氏禾的交叉传染。•病原菌主要从伤口侵入,菌脓可借风、雨、露等传播后进行再侵染。高温高湿等有利于病害发生。台风暴雨造成伤口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水过深加重发病。水稻细条病的发病特点•危害水稻的主要特点:主要侵害水稻叶片,病斑初呈暗绿色水橫状半透明小斑点,后逐渐沿叶脉方向扩展,成黄褐色,干结后呈黄色树胶状小粒,形如虚线,不易脱落。发病严iR吋,条斑融合成不规则的黄褐色至枯白色大斑块,外观与白叶枯病有些相似,但对光观察,病斑呈半透明状。病害流行时,叶片卷曲,完全呈一片白色。该病在水稻生长前期、后期都易感染,苗期症状较白叶枯病明显;病害严重时能引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使能够抽穗结实,但批谷增多,千粒重降低。一般年份可减产10%-20%,在气候条件沾发病严重时达40%。Rxo1基因来源•Rxo1基因是来自玉米的一个抗玉米细菌性条斑病的寄主抗性基因，将其转入水稻后转基因水稻中接种细菌性条斑病病原菌，在接种点处表现典型的HR表型，证实该基因为一重要的非寄主抗性基因。Rxo1基因定位•Rxo1基因CDS序列全长（从起始密码子ATG到终止密码子TAG）为2718bp。与许多R基因一样，该基因编码的产物是NBS-LRR结构的抗病蛋白（GenBank登录号为AAX31149.1），其蛋白质序列为905aa。根据SMART数据库软件扫描该蛋白的domains、repeats、motifs，找到一个从4-18位点的lowcompositionalcomplexity：IAVLLVLKKIAIALA及一个位于118-147的coiledcoilregion（LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK）；此外还预测到了37个其余结构（如UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADH-G_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、LRR_CC、LRR_TYP及LRR_SD22等），但是其显著性未达到极显著的阈值。Sanger的分析则找到3个Pfam-Amatchs，其中显著的一个是NB-ARC结构：envelope范围是183-470；比对结果的范围则是185-467；HMM范围为3-282；另有两个非显著的4个copy的LRR结构。基因Rxo1的双右边界双元载体的构建•1.1菌株和载体•含有9kbRxo1基因的pCAMBIA1305-1Rxo1质粒由美国堪萨斯州立大学ScotH.Hulbert博士提供。pCAMBIA1305-1质粒是由澳大利亚CAMBIA研究中心构建的含有35S启动子和细菌卡那霉素抗性基因的双元载体。采用的农杆菌菌株为EHA105。（1）美国Kansas州立大学的ScotH.Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1质粒，其中携带有外源目的基因Rxol;pCAMBIA1305-1质粒（2）澳大利亚CSIROPlantIndustry的MUpadhyaha博士提供双右边界双元载体pMNDRBBin6。该载体用于转接Rxol基因并将重组体转化到农杆菌中进行后续转基因:双右边界双元载体pMNDRBBin6结构图及可能产生的3种TDNA类型(3)农杆菌菌株为LBA4404;(4)大肠杆菌菌株为DHSa;1.2双右边界双元载体的构建1.感受态细胞的制备和转化2.双右边界双元载体构建（1）目的基因和载体的酶切连接•将携带Rxol基因的载体pCAMBIA1305-1用限制性内切酶SacI(AGTVACT),NgoMN(GVCCGGC)进行消化，同时，用限制性内切酶XmaI(CVCCGGG)和HpaI(GTTVAAC)消化载体pMNDRBBin6。将酶切后得到的目的基因片断和双元载体用T4噬菌体连接酶连接，连接产物转化至大肠杆菌。质粒pCAMBIA1305-1-Rxol经内切酶SacI和NgoMIV酶切，得到大小为8.Skb的Rxol目的基因片断(图A)，载体pMNDRBBin6经HpaI和XmaI酶切，得到大小为12.3kb的线性化双右边界载体(图B)A:SacI和NgoMN酶切pCAMBIAI305-I-Rxol;B:HpaI和XmaI酶切pMNDRBBin6;I:pCAMBIA1305-1-Rxol;2:pMNDRBBin6;M:250byDNAMarker.(2)阳性克隆筛选•将过夜连接产物转化大肠杆菌，在LB固体培养基(含SOmg/L壮观霉素)上涂布37℃培养，挑取转化子单克隆于LB培养基(含SOmg几壮观霉素)中振荡培养Sh;提取转化子质粒进行扩增，使用引物Rxol-F(5‘ACTCGGTAAACCTACGGACTGA-3’)和Rxol-R(5‘-CTTCCTGCAGGTATACCACTCC-3’)筛选获得阳性克隆;筛选出1个转化子，其特异性扩增片段与1.45kb目的基因片段Rxol大小相符。提取该克隆质粒DNA进行PCR扩增，扩增片段大小与阳性对照pCAMBIA1305-1-Rxol相同，将产物回收纯化连接到pMD20-T上测序，与目的基因序列比对相同，表明Rxol基因片段已整合到pMNDRBBin6载体中。1M2341:阳性对照pCAMBIA1305-1-itcol;M:1kbDNAlandderMarker;2:阴性对照pMNDRBBin6质粒;3:阳性克隆PCR扩增;4:阳性克隆的质粒PCR扩增;M:1kbDNAladdermarker.------1.45kb(2)对整合了Rxol基因的pMNDRBBin6载体使用HpaI和XmaI进行双酶切，应得到大小为20.875kb的片段。该阳性克隆的质粒经酶切后产生1条带约为20kb(图2.5)，与目的基因片段和pMNDRBBin6载体的长度之和相等记为pMNDRBBin6-Rxola1M—l0kb1:质粒;2:Marker.(3)pMNDRBBin6-Rxol经EcoRI酶切后产生4个片段，大小分别为9378bp,8576bp,1632bp和1268bp(9378bp和8576bp片段长度相近，图中合为一条粗带)(图2.6A);SacI酶切产生5个片段，大小分别为8525bp,5194bp,2683bp,1763bp和1528bp(图2.6B)图2.6阳性克隆质粒的EcoRICA)和SacI(B)酶切图谱.1:质粒;Ml:250byDNAladdermaker;M2:1kbDNAladdermarker.上述酶切结果与PremierPrimer5.0分析的理论酶切片段大小相符，表明Rxol基因整合到了双边界载体中，且位于TDNA相邻的左右边界之间。(3)阳性克隆酶切鉴定和PCR扩增(4)载体序列分析(5)保存阳性克隆，以备后续遗传转化工作。水稻的遗传转化•将处理好的种子诱导培养基MS（含100mL/LMS大量元素混合液上，26℃培养箱中暗培养约30天。•（1）继代培养•将上述诱导的质地紧密、色泽鲜艳的胚性愈伤组织在超净台中用镊子剥离，转移到继代培养基中（MS培养基，如上），2周后选择原胚性愈伤组织分化出来的质地均匀、颗粒较小、色泽良好的愈伤颗粒继代一次，共继代2次。（2）农杆菌活化•将超低温保存的农杆菌划线于含50mg/L卡那霉素的YEB培养基上，28℃培养箱中培养24h；挑取单菌落，接于2mL含有50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃摇床中振荡培养约36小时；用移液枪吸取1mL新鲜菌液接于50mL含50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，摇菌至OD600为0.8-1.0；将活化好的农杆菌离心，4000rpm，10min，去上清后重悬于AAM-As（100含mL/LAAM大量元素、5mL/L上述铁盐、0.1mg/LVB1、0.6mg/LVB6、0.5mg/L烟酸、0.75mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、876mg/L谷氨酰胺、266mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.5g//L酪蛋白、68.5g/L蔗糖及36g/L葡萄糖，调节PH至5.2，灭菌后冷却至约60℃的培养基中加入1mL10mmol/L的乙酰丁香酮）液体培养基中，28℃，200rpm振摇3-4小时，用分光光度计调节OD600为0.7-1.0，即可用于分装、侵染愈伤组织。（3）侵染、共培养与筛选•材料为在继代培养基上生长4-5天的愈伤组织，将愈伤组织转移到灭菌滤纸上吸湿20min后转移到调好浓度的菌液中；摇床中缓慢摇晃20-30min；•倒掉菌液，于灭菌滤纸上吸弃多于菌液；取出愈伤，播于铺有一层滤纸的共培养培养基（PH为5.2的MS培养基）中，20℃生化培养箱中恒温培养2-3天。•当共培养的愈伤周围出现明显的菌体时，将其转移至灭菌滤纸上，吸去表面菌体后用含有150mg/L头孢噻奎钠和200mg/L羧苄青霉素的无菌水中，100rpm振荡30min，重复3次；将洗过的愈伤转移至灭菌滤纸上，吸取多于水分；•将愈伤接入筛选培养基（含有150mg/L头孢噻奎钠和200mg/L羧苄青霉素及50mg/L潮霉素）中，26℃避光筛选15-20天后将未变黑的愈伤转移到新的筛选培养基，重复2次。（4）植株再生•将筛选培养基上的抗性愈伤组织介入预分化培养基（含有N6大量、MS微量、铁盐、1mg烟酸、10mgVB1、1mgVB6、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g甘氨酸、0.5g脯氨酸、30g蔗糖、3g植物凝胶、2.2mgNAA、2.5mg6-BA，PH为5.8）上，26℃暗培养7天后在12小时光照、12小时黑暗的条件下培养7天。•将预分化的抗性愈伤组织接入铺有无菌滤纸的培养皿中，干燥处理3小时后转移到分化培养基（每升含有N6大量、MS微量、铁盐、1mg烟酸、10mgVB1mgVB6、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g甘氨酸、0.5g脯氨酸、30g麦芽糖、3g植物凝胶、0.5mgNAA、1.5mg6-BA，PH为5.8）上，在26℃环境中12小时光照及12小时避光的条件下，培养至愈伤变绿，长出少量根，且分化出茎叶。（5）生根培养•当分化的小苗生长到4-5cm时，将其转移到生根培养基（每升中含25mLMS大量元素、5mLMS微量元素混合液、5mL铁盐、30g蔗糖、3g植物凝胶、0.1mg/LNAA、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g谷氨酰胺及0.5g脯氨酸，调节PH至5.8）上，上述温度和光照的条件下继续培养30天左右。（6）壮苗与炼苗•将小苗经7天温室炼苗后，转移到人工气候室水培20天，再转移至隔离的网室中种植。（7）转基因后代的表型检测与分子检测•当植株生长到分蘖盛期时，用针刺法接种毒性Xoc小种，分别在第3天、第5天、第7天及第10天观察记录接种点的反应表型。•DNA提取：CTAB法提取转移至网室种植的基因工程苗的基因组DNA（经液氮速冻后研磨的约0.1g叶片粉末中加入400μLCTAB提取液；65℃水浴40分钟，期间摇晃混匀2次；•8000rpm离心10分钟后吸取上清；上清中加入等体积的24:1氯仿：异戊醇，摇床上100rpm5min；10000rp离心10分钟；•吸取转移上清至新管，加入2/3体积预冷的异丙醇后混匀；-20℃下放置30min以上；•10,000rpm离心5min，弃废液；用酒精洗两遍，室温下风干，加入200μL溶解DNA;1%琼脂糖凝胶电泳检测质量）。基因检测•为了检测所转基因的拷贝数，采用了Nothern杂交的方法（杂交步骤见地高辛