抗肿瘤药效学指导原则

抗肿瘤药物药效学指导原则(讨论稿)1基本原则抗肿瘤药物可分为：(1)细胞毒类药物(cytotoxicagent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等；(2)生物反应调节剂(biologicalresponsemodifier)；(3)肿瘤耐药逆转剂(resistancereversalagent)；(4)肿瘤治疗增敏剂(oncotherapysensitizer)；(5)肿瘤血管生成抑制剂(tumorangiogenesisinhibitor)；(6)分化诱导剂(differentiationinducingagent)；(7)生长因子抑制剂(growthfactorinhibitor)；(8)反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide)等。抗肿瘤药物的药效学包括体内外抗肿瘤试验，评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制的初步研究。2体外抗肿瘤活性试验2.1试验目的(1)对候选化合物进行初步筛选；(2)了解候选化合物的抗瘤谱；(3)为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等。2.2试验方法选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的和所选用的方法选择相应的细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT]还原法、XTT{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphonyl)-5-[carboxanilide]-2H-tetrazoliumhydroxide}还原法、磺酰罗丹明B(sulforhodamineB,SRB)染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。药物与细胞共培养的时间一般为48-72小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。2.3评价标准以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线，然后采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。体外试验至少重复一次。3体内抗肿瘤试验体内抗肿瘤试验结果是评价候选抗肿瘤化合物有效性的最重要指标。体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植瘤模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。鼓励使用人癌裸小鼠移植瘤模型和多种类的移植瘤模型，以较正确和全面地评价候选化合物的抗瘤活性和抗瘤谱。鼓励使用原位接种模型和中空纤维测定(hollow-fiberassay)等先进的抗肿瘤作用评价方法。3.1动物动物要求健康，符合等级动物要求，有实验动物合格证。雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同。小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克。评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠。3.2肿瘤模型3.2.1小鼠肿瘤模型可应用的小鼠肿瘤模型包括淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及以上各种小鼠肿瘤的亚型和耐药瘤等。3.2.2人癌裸小鼠移植瘤模型应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌移植瘤试验。模型的建立和使用请注意以下几点：(1)移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。(2)移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。(3)对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型。(4)为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少15-20代。3.3试验过程3.3.1接种肿瘤接种方法主要有皮下接种、腹腔接种和原位接种。皮下瘤模型：选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、酒精或新洁尔灭消毒动物皮肤，切开皮肤，剥离肿瘤。将瘤组织剪成1.5mm3左右，用套管针接种于动物一侧或双侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为（1-5）×106。腹水瘤模型：无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水，以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数量一般为（1-5）×106。原位接种模型：原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏器，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性，是鼓励使用的方法。主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。3.3.2分组和剂量设置分组：试验分阴性对照组、阳性对照组、治疗组。治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组，裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100—300mm3后将动物随机分组。治疗组动物数普通小鼠每组至少10只，裸小鼠至少6只。阴性对照组动物数为治疗组动物数试验组数。剂量设置：治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置，高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量。阴性对照组给予相应的溶剂；阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物，如试验化合物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳性对照药。阳性对照药选择原则为：（1）疗效确切；（2）与被试物质化学结构类似；（3）与被试物质有类似的作用机理。3.3.3药物配制，给药时间和给药途径药物配制：溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用小量酸(0.1-0.5NHCl)或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，调节pH在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或用吐温60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射。给药时间和给药途径：分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。静脉给药和口服给药是较为理想的给药途径。给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的。特殊情况下根据药物作用特点和推荐临床给药方法可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。不可采用从饮水中给药的方式。3.4评价标准3.4.1腹水瘤模型接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数。如阴性对照组20%动物存活时间超过4周，表明腹水瘤生长不良，实验作废。采用中位生存时间(即mediansurvivaltime,MST)来评价每组生存时间，其计算公式为：每组鼠数的中间数-中间生存天数前死亡的鼠数MST=（中间生存天数-0.5）+中间生存天数死亡的鼠数治疗组与对照组的比较，采用T/C（%）来表示。计算公式为：TMSTT/C%=────×100%CMSTTMST：治疗组MST；CMST：阴性对照组MST。评价的标准则以125%为界，当T/C%≥125%时，视为有效，反之则无效。报告格式见表1。表1XXX对腹水瘤XXX的实验治疗作用。组别剂量给药动物数开始体重(克)中位生存时间T/C方式（只）(xSD)(天）（%）阴性对照阳性对照治疗组高剂量中剂量低剂量3.4.2裸小鼠移植瘤模型推荐使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2-3次,每次测量同时还需称鼠重。肿瘤体积(tumorvolume,TV)的计算公式为：V=1/2×a×b2或π/6×a×b×c其中a、b、c分别表示长宽高。由于此两公式的相关性极好，可采用任一公式。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relativetumorvolume，RTV），计算公式为：RTV=Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C（%），计算公式如下：TRTVT/C%=────×100%CRTVTRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。疗效评价标准：T/C%60%为无效；T/C%≤60%，并经统计学处理P0.05为有效。报告格式见图1和表2；并应提供相应照片。表2XXX对人癌裸小鼠移植瘤XXX的实验治疗作用。组别剂量给药动物数平均体重(克)TV(x±SD)RTVT/CP值方式d0dnd0dnd0dn(x±SD)(%)阴性对照阳性对照治疗组高剂量中剂量低剂量d0:分笼给药时间；dn:实际治疗疗效最佳的时间。注：图中为示意曲线。图1XXX对人癌裸小鼠移植瘤XXX的生长抑制作用。3.4.3小鼠肿瘤模型生长较慢的小鼠肿瘤采用与裸小鼠移植瘤同样的量瘤径的评价方法。生长较快的小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。试验结束后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克，或20%肿瘤重量小于400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。疗效评价公式：给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重肿瘤生长抑制率=─────────────────×100%00.20.40.60.811.21.41.60361013172024时间(天)移植瘤体积(cm3)阴性对照阳性对照高剂量中剂量低剂量阴性对照组平均瘤重评价标准：肿瘤生长抑制率40%为无效；肿瘤生长抑制率≥40%并经统计学处理P0.05为有效。报告格式见表3，并应提供相应照片。表3XXX对动物移植瘤XXX的实验治疗作用。动物数平均体重(克)组别剂量给药──────────瘤重(克)抑瘤率P值方式开始最后开始最后(x±SD)(%)阴性对照阳性对照治疗组高剂量中剂量低剂量3.4.4原位接种模型不同的原位接种模型可采用不同的评价方法，主要有瘤重和生存时间评价法。如肝原位接种可用瘤重评价，颅内接种可用生存时间评价。评价方法、标准和注意事项同腹水瘤模型和小鼠肿瘤模型。4各种类型抗肿瘤药物的特殊要求I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制的初步研究。非细胞毒类药物除完成上述体内外抗肿瘤试验，还应进行以下试验以证明其特定的抗肿瘤作用。4.1生物反应调节剂药效学包括两个方面：体内抗癌试验和免疫功能的研究。4.1.1体内抗癌试验除参照本章“体内抗肿瘤试验”部分，尚应注意以下几点：模型因裸小鼠是免疫缺陷动物，一般应用正常免疫小鼠肿瘤模型。给药时间可按常规给药，也可在肿瘤接种前预先给药几天，肿瘤接种后继续给药或停药。肿瘤细胞接种量用于观察BRM类药物的肿瘤细胞接种量可比细胞毒类药物低一个数量级，一般为(1-5)105个瘤细胞/小鼠。给药方法可单独给药，也可与其它抗肿瘤药物合并使用，观察增效或减毒作用。4.1.2免疫功能试验方法具有抑瘤作用的生物反应调节剂，还需作免疫功能测定,以明确其抑瘤作用是否与免疫功能调控有关。免疫功能测定至少应做三项以上(第二、第三和第五项必做)，包括细胞免疫和体液免疫两方面。检测方法详见本书“抗炎免疫药物药效学指导原则”中的“免疫调节药”部分。巨噬细胞功能测定天然杀伤细胞(naturalkillcell)测定淋巴细胞转化试验淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphocyte-activatedkillercell)测定各种细胞因子(cytokine)测定包括白介素II(IL-2)、白介素VI(IL-6)、白介素XII(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。迟发型超敏反应检测4.2肿瘤耐药逆转剂4.2.1体外抗耐药活性试验选择2-3对肿瘤耐药/敏感细胞株，采用MTT法、XTT法或SRB法测定药物的细胞毒性。一般在无毒剂量或相当于IC10的剂量下设三个剂量，并设立相应的阳性和阴性对照组