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徐禾丰分析方法验证拉呋替丁超高效液相色谱稳定性指示性方法开发与验证现代验证系列目的•明确分析方法开发过程与要点•明确在验证中所需要考虑问题•了解开发过程与验证的关系2材料和试剂•拉呋替丁及其四个杂质来自实验室•正磷酸氢二氨,HPLC级,默克•氨水,AR级,默克•乙腈,梯度淋洗级,J.T.Baker•高纯去离子水,Millipore纯水制备系统3拉呋替丁四个杂质4仪器与操作条件•Waters’AcquityUPLC系统•四元梯度泵•自动进样器•柱温箱•光电二极管阵列检测器•用Empower软件V3对输出信号监测和处理5使用柱开发用柱:AcquityUPLCBEH-C18(2.1mm50mm,1.7m)AcquityCSHphenyl-hexyl(2.1mm100mm,1.7m)AcquityUPLCBEH-shieldRP18(3.0mm100mm,1.7m)分析用柱AcquityUPLCBEH-shieldRP18(3.0mm100mm,1.7m)6色谱条件恒温:35C流动相A:磷酸盐缓冲液(0.02M磷酸氢二铵水溶液,用氨水调整pH到9)以及乙腈,80:20(V/V)流动相B:磷酸盐缓冲液以及乙腈,30:70(V/V)流量:0.5ml/min进样量:4l7梯度条件8时间T(分)A(V)B(V)0.0110002.075253.0604010307012307012.51000161000数据获得波长:276nm洗脱时间:16分钟数据处理:通过Empower软件V3.0处理9强制降解研究•光电二极管阵列探测器•扫描范围200nm到400nm•计算峰纯度10溶液制备稀释剂:700ml水与300ml乙腈均匀混合物拉呋替丁储备液:1,000g/ml杂质储备液:每个杂质150g/ml杂质定量标准液:按照每个杂质规格标准(0.15%)进一步稀释杂质储备11制剂样品•粉碎20片拉呋替丁片,准确称量,配制相当于1,000g/ml溶液•加总体积50%稀释剂,超声约15到20分钟•稀释到规定体积,用0.45m尼龙过滤器过滤•收集清液用于分析制剂有关物质•进一步稀释到100g/ml用于制剂含量测试12分析方法•在拉呋替丁浓度为1,000g/ml分别加入0.15%的四个,作为系统适用性混合物•在给定色谱条件下,分别将进样4l系统适应性溶液,一式六次•拉呋替丁与杂质D之间分离度不小于2.0•六次进样所有杂质峰面积相对标准偏差不超过5.0%13降解研究液体处理条件:酸,碱,氧化•配制原料药1,000g/ml稀释液溶液•处理•0.1N盐酸(90C加热1小时)•0.1N氢氧化钠(90C加热1小时)•30%过氧化氢水溶液•稀释到刻度•按照色谱条件分别进样14降解研究固体处理条件:光照,加热•原料药在经过校准60C烘箱内加热24小时•光降解样品按照ICH指南暴露到紫外光7天•经过处理样品用稀释剂稀释到所需的1,000g/ml•按照规定方法进样15降解研究•对所有降解样品中的拉呋替丁与杂质进行定量•用光电二极管阵列检测器来建立每个降解条件峰纯度16方法开发•用高效液相色谱法对拉呋替丁,原料药,制剂含量与相关杂质进行测定•由于运行时间60分钟左右,比较长,没有对高效液相色谱法进行验证•转移到UPLC,其运行时间从60分钟减少到16分钟•开发UPLC方法核心目的是检测并确定拉呋替丁原料药与制剂中潜在杂质,并实现所有四个杂质及在降解研究中生成降解产物分离17UPLC色谱条件开发与优化方法开发•在开发过程中使用了各种UPLC固定相•AcquityUPLCBEH-C18(2.1mm50mm,1.7m)•AcquityCSHphenyl-hexyl(2.1mm100mm,1.7m)•AcquityUPLCBEH-shieldRP18(3.0mm100mm,1.7m)•基于例如分离度,拖尾因子,选择性,特别是对酚类的杂质A,最后用AcquityUPLCBEH-shieldRP18(3.0mm100mm,1.7m)18UPLC柱选择方法开发•开发中试验了pH从3.0到10.0缓冲液•磷酸盐•硫酸盐•醋酸盐•在碱性缓冲液pH约8.0当于磷酸缓冲液的分离度与拖尾因子令人满意•因此选择磷酸氢二铵盐缓冲液用于分析19缓冲系统选择方法开发•在流动相B评价了乙腈与甲醇•在流动相B中使用乙腈具有更好的分离度与拖尾因子•甲醇尝试作为一个有机改进剂时,所有峰拖尾因子都不在系统适用性标准范围内•因此乙腈用于分析中的有机改进剂20有机改进剂选择方法开发•预混缓冲区液与有机改进剂符组合制备流动相A与流动相B来改善基线干涉•尝试了各种时间程序组合,最后确定所有杂质与降解产物都与拉呋替丁主峰分离•所选定波长276nm,是拉呋替丁紫外吸收最大值•选择优化柱温为35C使关键的拉呋替丁与杂质D的分离度最大21色谱条件优化方法开发•选择3mm直径流量0.5ml/min的理由是流量增加减少杂质D与拉呋替丁之间分离度小于2.0,不能接受•计算总流量不考虑2m粒径影响,因为在宽泛流量率恒定时,从VanDeemter曲线,在大约1.7m粒子大小,可以达到最低等量理论塔板高度(或最高分离度)22色谱条件优化方法开发典型保留时间•杂质A:1.37分•杂质B:1.75分•杂质C:3.64分•杂质D:4.79分•拉呋替丁:5.04分23色谱条件优化典型图谱24空白典型图谱25标准杂质鉴定•在拉呋替丁中在0.15%水平加入1,000g/ml的杂质A,B,C,D来确认在选定条件下杂质保留时间•所有杂质是彼此很好分离•在已确定杂质中•杂质A,B来自降解•杂质C来自关键起始物料与降解杂质•杂质D为相关杂质26系统适用性标准•系统适应性试验是基于取得的几个代表光谱分析结果来确定•分析物峰柱效20,000•拖尾因子2.0•系统适用性溶液六次进样杂质峰面积相对标准偏差(RSD)5.0%•系统适用性溶液拉呋替丁与杂质之间分离度2.027系统适应性测试结果28物质相对保留时间理论塔板数拖尾因子(T)分离度(Rs)杂质A0.2725,7211.33-杂质B0.3535,8011.105.69杂质C0.7226,9131.6021.64杂质D0.9529,2111.1411.12拉呋替丁1.0032,4691.152.93专属性•降解研究数据显示降解产物与拉呋替丁良好分离(纯度角度小于纯度阈值)•观察到在酸,碱,过氧化氢溶液重大降解29降解实验图谱30酸降解降解实验图谱31碱降解降解实验图谱32氧化降解强制降解结果33降解条件拉呋替丁含量(%)结果与平衡峰纯度角峰纯度阈值未处理98.74-0.2050.530酸84.2911.71%未知降解物以及其它杂质0.1220.391碱84.65杂质B增加到6.96%,杂质C增加到4.06%,3.85%未知降解物以及其它杂质0.1650.433氧化85.21未知降解物增加到8.48%以及其它杂质0.0720.341热98.97已知与未知杂质无显著变化0.2140.505光98.85已知与未知杂质无显著变化0.2140.505线性•稀释杂质储备液到需要浓度•定量限到250%六个浓度•LOQ,0.75,1.2,1.5,2.25,3.75g/ml•对数据用统计分析中的线性回归模型34检测限/定量限•按照峰面积标准偏差与线性数据斜率确定检测限与定量限•杂质A,杂质B,杂质C,杂质D的检测限与定量限度分别从0.007%至0.022%,0.008%至0.023%•定量限浓度用6次进样精密度计算•定量限精密度从1.22%至9.78%35精密度系统精密度•有关物质测定的系统精度用系统适应性混合物•进样六次•拉呋替丁与杂质峰精密度从0.36%至1.30%36精密度方法精密度研究包括方法精密度与中间精密度•有关物质方法精密度通过分析六个加杂质A,杂质B,杂质C,杂质D样拉呋替丁样品溶液•评价每个相关杂质的相对标准偏差RDS(n=6)•在中间精密度研究中用同样的规程,不同分析师,不同流动相,不同稀释剂,不同仪器,不同日期,相同品牌但不同批号的柱•有关物质百分比相对标准偏差在0.4%-1.5%37准确度•所有的有关物质方法准确度通过测试加样的拉呋替丁样品溶液得到•在七个不同浓度加样•LOQ,20%,40%,50%,80%,100%,150%一式三份•所有相关物质回收率在接受标准80.0%–120.0%范围内38分析溶液稳定性•在特定程度上在拉呋替丁溶液中加有关物质•立即分析,不同时间间隔分析,最后达48小时•样品溶液保持在25C•在这样的条件下,48小时内稳定39耐用性•评价开发方法的耐用性,人为改变色谱条件,评估洗脱对,杂质D与拉呋替丁峰分离度•流量影响:改变了0.1单位,即从0.4ml/min到0.6ml/min•温度影响:32C到38C•所有其他流动相成分保持不变•在上述条件下,拉呋替丁拖尾因子小于1.30,任何两个峰之间分离度大于2.0•所有改变条件对拖尾因子与分离度影响微小,说明该方法耐用40样品分析41样品来源杂质A杂质B杂质C杂质D制剂产品一号未检出未检出未检出0.05二号未检出未检出未检出0.04原料药一号未检出未检出小于检出限0.04二号未检出小于检出限小于检出限0.03三号未检出小于检出限小于检出限0.04验证结果42物质有关物质杂质A杂质B杂质C杂质D精密度(平均值标准偏差)方法精密度(n=6)0.151±0.870.155±0.400.162±1.220.155±0.91中间精密度(n=6)0.152±0.850.158±0.380.161±1.300.157±0.93全部结果(n=12)0.152±0.860.156±0.390.162±1.260.156±0.92验证结果43物质有关物质杂质A杂质B杂质C杂质D检测/定量限度检测限0.0080.0080.0160.016定量限0.0230.0240.0480.049验证结果44物质有关物质杂质A杂质B杂质C杂质D相关杂质线性与范围:从定量限到规格标准250%相关系数0.99910.99990.99620.9995斜率55146.1565742.5657225.1340483.59截距115.890174.74945-685.58731.98923验证结果45物质有关物质杂质A杂质B杂质C杂质D准确度(平均回收率):从定量限到规格标准150%定量限92861069020%103102859940%1021029210250%1091019510080%10110198101100%10210198102150%10110010199徐禾丰分析方法验证拉呋替丁超高效液相色谱稳定性指示性方法开发与验证现代验证系列
本文标题:拉呋替丁超高效液相色谱稳定性指示性方法开发与验证.
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