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木聚糖酶出发菌株LXY-8的筛选及产酶条件考察许海艳,卢衍花,张志云,李永胜,杨翔华*(辽宁石油化工大学环境与生物工程学院;辽宁抚顺,113001)摘要:从近200份样品中分离筛选出酶活较高的木聚糖酶菌株LXY-8,经形态特征、生理生化鉴定其为根霉属。产酶最适条件为:温度30℃;木聚糖酶起始pH4.6,纤维素酶初始pH5.0;在pH2~7范围内,残余酶活保持在80%以上;Mg2+、Co2+、Na+、K+等金属离子对酶活有促进作用。关键词:木聚糖酶,根霉属,酶学性质中图分类号:Q939.9文献标识码:A文章编号:ScreeningofXylanasestrainandstudiesonitsconditionofproducingenzymeXUHaiyan,LUYanhua,ZHANGZhiyun,LIYongsheng,YANGXianghua(CollegeofEnvironmentandBioengineering,LiaoningShihuaUniversity,Fushun113001,China)ABSTRACT:separation,isolatingandpurificationsomestemsofgermengenderingxylanasesthroughnearly200samples,weselecttheLXY-8strainofhighestxylanaseactivity.ItwasidentifiedasRhizopus.Thestudiesonenzymacaticcharacterizationindicatethattheoptimumconditionswere:temperatureis30℃;initialpHofxylanaseis4.6,initialpHofcellulolyticenymeis5.0;theremnantxylanaseaxtivitywouldbe80%whenthepHvauleis2~7;mentalionCo2+、Mg2+、Na+、K+hassimulativefunctiontoenzymicactivity.Keywords:xylanase,Rhizopus,enzymacaticcharacterization玉米秸杆和玉米芯中富含半纤维素,其主要成分是木聚糖,但多未有效利用。木聚糖酶能利用其中的半纤维素生产经济价值较高的产品,且其主要水解产物为低聚木糖,可增殖动物肠道内的双歧杆菌[1],具有特殊的生理功能,木聚糖酶还可用于纸浆的预漂白,有效降低环境污染,其在饲料、食品、和造纸等行业中广泛的应用前景。1实验器材1.1实验材料1.1.1样品来源:土样、腐烂的玉米秸杆、玉米芯、牛胃瘤胃及牛粪等。1.1.2主要实验仪器蒸汽高压灭菌器、VIS-7220型分光光度计、霉菌实验箱、LD5-10型离心分离机、无菌空气净化台、生化培养箱冰箱。1.1.3培养基组成(1)马铃薯葡萄糖培养基(PDA)[2]:马铃薯20g,葡萄糖2g,琼脂2g,水100ml。(2)固体初筛培养基:6g玉米秸秆,2%的营养盐(g/L)(KH2PO43.0,CaCl20.5,MgSO47H2O0.5,NaNO33.0,FeSO4·7H2O7.5×10-3,MnSO4·H2O2.5×10-3,ZnSO42.0×10-3,CoCl23.0×10-3,自然pH值),9.0ml水。(3)液体培养:马铃薯浸出液500mL,葡萄糖10g,121℃条件下灭菌30min。2实验方法2.1菌株的鉴定方法[3]2.2菌种的发酵及粗酶液的制备将分离到的株菌分别接种到装有50mL液体培养基的三角瓶中,30℃振荡培养(转速为125r/min)培养6d,将培养液于4℃、4000r/min离心分离15min,取上清液作为粗酶液。2.3木聚糖酶活测定[4]3结果与讨论3.1菌种的分离筛选从近200分土样、腐烂的玉米芯、玉米秸秆及牛胃、牛粪[5]中分离纯化出LXY-1、LXY-2、LXY-3、…、LXY-30,这30种菌在固体初筛培养基中都产生明显的半纤维素水解圈,说明对玉米秸秆做底物的木聚糖具有明显的降解作用。测粗酶液中木聚糖酶活、纤维素酶活,从中选出酶活较高的5种菌株,结果见图1。05001000150020002500300035003891718菌株编号酶活力(u/ml.min)木聚糖酶活纤维素酶活图1木聚糖酶活和纤维素酶活力测定结果如图1,LXY-8菌株产木聚糖酶和纤维素酶活力最高,分别达到3158u/ml.min、1885u/ml.min。所以选择该菌株进行培养,并对其酶学性质进行研究。3.2对LXY-8菌株产生酶性质的考察3.2.1发酵起始PH值对产酶的影响在不同pH值的0.2mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中LXY-8水解木聚糖的活力不同。24682000250030003500400045005000pH值木聚糖酶活(U/g)木聚糖酶活100012001400160018002000纤维素酶活(U/g)纤维素酶活图2发酵起始pH值对木聚糖酶和纤维素酶活的活性的影响如图2,LXY-8菌株在较低的pH环境中有利于木聚糖酶及纤维素酶的合成。木聚糖酶活在固体培养基初始pH为4.6时最高,可达4782U/g,纤维素酶活在初始pH为5.0时最高,可达1885U/g。3.2.2木聚糖酶酸碱稳定性的考察图3木聚糖酶的稳定性的考察如图3,LXY-8菌株产木聚糖酶在pH2~7范围内酸碱稳定性较好,残余酶活保持在80%以上。3.2.3氧气含量对该菌株产酶的影响表1氧气含量对该菌株产酶的影响24681012102030405060708090100残余酶活(%)pH值如表1,氧气含量较小时,产酶活力较弱。氧气含量过大,则生长条件改善,生长旺盛,很明显该菌是好氧菌,充足的氧气量对它的生长是十分必要的,但并非最适产酶条件。3.2.4发酵温度对产酶的影响温度对LXY-8菌株的生长和木聚糖酶的产生有着显著的影响。0100020003000400050006000202530354045发酵温度(℃)酶活力(u/g)纤维素酶活木聚糖酶活图4发酵温度对产酶的影响如图4,LXY-8的最适固体发酵温度为30℃,此时木聚糖酶活最高为4789U/g,纤维素酶活也较高为1883U/g。3.2.5金属离子对菌株产酶活力的影响加入的各金属离子,其对酶活的影响如下。表2金属离子对LXY-3菌株产木聚糖酶活的影响试剂(0.02mol/L)相对活性(%)试剂(0.02mol/L)相对活性(%)对照(H2O)100HgCL228.9NaCL118.1BaCL2·2H2O89.2KCL112.6MgSO4·7H2O137.4CaCL2·2H2O96AgNO335.8FeSO4·6H2O86CuSO4·5H2O9.6ZnSO4FeCL3·6H2O7578CoCL2NiCL2124.643.5如表2,以水作化合物时的产酶活力为标准,对比可以得出:Hg2+、Ag+、Cu2+、Ni2+对木聚糖酶的活性有抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最强,酶活损失近90%;Mg2+、Co2+、Na+、K+对木聚糖酶有促进作用,Mg2+和Co2+等的激活作用较大,可使酶活性提高37.4%和24.6%,其它离子如Ca2+对酶活的影响较小。4结论25×250试管装固体料量(mg)35810酶的活力(U/g)3112.74062.11810.81511.9筛选得到30株菌株,其中的高产株菌LXY-8为黑色灰色菌落,特征与毛霉相似,菌丝也为白色、无隔多核的单细胞真菌,多呈絮状,经生理生化指标测定其符合黑根霉的定义,初步鉴定其为黑根霉。本试验考察了酶的性质最终确定其发酵的最佳温度为30℃,起始pH值木聚糖酶为4.6,纤维素酶为5.0。酶在pH2~7范围内稳定性较好,残余酶活保持在80%以上。Mg2+、Co2+、Na+、K+等金属离子对酶活有促进作用。LXY-8菌株产生的木聚糖酶活力很高,同时其纤维素酶的活力也较高,使分离提取两种酶制备酶制剂和用作饲料添加剂成为可能。参考文献[1]赵林果,余世袁.生物制备功能性木低聚糖.南京林业大学学报,2000,24(6):27~30[2]杨翔华,洪新.产木聚糖酶菌株的筛选及其产酶特性[J].辽宁石油化工大学学报,2004,24(4):32~35.[3]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001,79~86.[4]李彩霞,房桂干.木聚糖酶活测定方法.纸和造纸,2001,11(1):60~61[5]CattaMA,ZeltwangerRL.ApplEnviroMicrobiol1995,61:4396~4402
本文标题:木聚糖酶出发菌株LXY的筛选及产酶条件
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