木聚糖酶和CMC活力的测定方法

木聚糖酶活力的测定方法1.方法：3，5—二硝基水杨酸比色法，简称DNS法。2.原理：还原糖能将3，5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3—胺基5—硝基水杨酸。溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。3.主要仪器和设备天平（感量1mg和0.1mg两种），离心机，恒温水浴锅，磁力搅拌器,分光光度计（722型，符合GB9721的有关规定）。4.试剂和溶液4.1所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水,化学药品除特别要求外,均为分析纯。4.2DNS试剂称取3，5—二硝基水杨酸10g加入500ml水中，分多次加入氢氧化钠16g，搅拌溶解(温度＜45℃)，再分多次加入酒石酸钾钠300g，搅拌至全溶，冷却后用水定容至1000ml。室温下棕色瓶储存暗处放置，一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。4.30.1mol/L，pH5.0醋酸—醋酸钠缓冲液吸取冰醋酸1.8ml,加适量水，加醋酸钠5.78g，溶解,定容至1000ml,调节PH至5.00±0.01后使用。室温下存放2个月有效。4.40.1%即1mg/ml木糖标准溶液无水木糖于80℃烘至恒重，称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。4.51.0%木聚糖溶液称取木聚糖1.00g于烧杯中，用2ml0.5mol/L氢氧化钠润湿成糊状，加40ml缓冲液，于60～70℃水浴中加热溶解，冷凉后用0.5mol/L醋酸（约2ml）调pH5.0，转入容量瓶中,加缓冲液(4.3)定容至100ml。如果冰箱中放置时间长了出现沉淀，使用前应在热水浴中热溶。4.6木糖标准曲线的绘制吸取1mg/ml木糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于试管中，补水至2ml，加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度（A）。以吸光度为纵坐标，木糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y＝ax﹢b,求出吸光度与木糖量的关系。5.待测酶样品的处理5.1液体酶:直接吸取酶液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。5.2液体曲：离心上清液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。5.3固体曲：按干重计称取4g于三角瓶中，加水200ml，室温下磁力搅拌浸提0.5h。取离心上清液做适当稀释。5.4固体粉状酶：称取适量于烧杯中(精确至0.0001g)，用少量水润湿并调成糊状，再用水溶解，离心上清液做适当稀释。5.5固体粒状酶：研磨成粉后如5.3处理。6.酶活力测定取15ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(吸取前摇匀)(4.5)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致,50℃水解10min.反应步骤及试剂、溶液用量见下表:试样空白1.加底物(4.5)1.8ml1.加底物(4.5)1.8ml2.50℃预热3min2.50℃预热3min3.加酶液0.2ml3.50℃水解10min4.混合4.加DNS试剂3ml5.50℃水解10min5.混合6.加DNS试剂3ml6.加酶液0.2ml7.混合7.混合8.沸水浴中10min8.沸水浴中10min9.冷却定容至15ml9.冷却定容至15ml10.空白调零540nm下测定10.空白调零540nm下测定7.酶活力单位计算酶活力＝(S×D×1000)/（0.2×10）×1.7µg/ml(g).min式中：S—测得光吸收在标准曲线上对应的木糖量，mg数；D—酶液或酶粉稀释倍数；1000—mg和µg之间的换算系数；0.2—测定所取酶液量，ml数；10—反应时间，min数；1.7—方法换算系数。8.酶活力单位定义及换算8.1本方法酶活定义:在本测定条件下，每分钟水解木聚糖产生1µg还原糖（以木糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。国际酶活单位的定义:在测定条件下,每分钟水解木聚糖产生1µmol还原糖（以木糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。8.2u与国际单位IU的换算关系：1u＝1÷150IU（µmol糖/ml(g).min）150:木糖的分子量内切纤维素酶(CMC酶)活力的测定方法1.方法：3，5—二硝基水杨酸比色法，简称DNS法。2.原理：还原糖能将3，5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3，5—硝基水杨酸。溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。3.主要仪器和设备天平（感量1mg和0.1mg两种），离心机，恒温水浴锅，磁力搅拌器,分光光度计（722型，符合GB9721的有关规定）。4.试剂和溶液4.1所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水,化学药品除特别要求外,均为分析纯。4.2DNS试剂称取3，5—二硝基水杨酸10g加入500ml水中，分多次加入氢氧化钠16g，搅拌溶解(温度＜45℃)，再分多次加入酒石酸钾钠300g，搅拌至全溶，冷却后用水定容至1000ml。室温下棕色瓶储存暗处放置，一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。3.30.1mol/L，pH4.80醋酸—醋酸钠缓冲液吸取冰醋酸2.4ml,加适量水，加醋酸钠4.92g，溶解,定容至1000ml,调节PH至4.80±0.01后使用。室温下存放2个月有效。3.40.1%即1mg/ml葡萄糖标准溶液无水葡萄糖于80℃烘至恒重，称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。3.51.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液称取CMC-Na1.50g于烧杯中,加适量缓冲液置于水浴中加热(＜50℃)溶解成胶状，转入容量瓶中并用缓冲液(4.3)定容至100ml,置冰箱中备用。3.6葡萄糖标准曲线的绘制吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于试管中，补水至2ml，加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度（A）。以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y＝ax﹢b,求出吸光度与葡萄糖量的关系。4待测酶样品的处理5.1液体酶:直接吸取酶液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。5.2液体曲：离心上清液做适当稀释，使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。5.3固体曲：按干重计称取4g于三角瓶中，加水200ml，室温下磁力搅拌浸提0.5h。取离心上清液做适当稀释。5.4固体粉状酶：称取适量于烧杯中（精确至0.0001g），用少量水润湿并调成糊状，再用水溶解，离心上清液做适当稀释。5.5固体粒状酶：研磨成粉后如5.3处理。6酶活力测定取15ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(吸取前摇匀)(4.5)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致,50℃水解30min.反应步骤及试剂、溶液用量见下表:试样空白1.加底物(4.5)1.8ml1.加底物(4.5)1.8ml2.50℃预热3min2.50℃预热3min3.加酶液0.2ml3.50℃水解30min4.混合4.加DNS试剂3ml5.50℃水解30min5.混合6.加DNS试剂3ml6.加酶液0.2ml7.混合7.混合8.沸水浴中10min8.沸水浴中10min9.冷却定容至15ml9.冷却定容至15ml10.空白调零540nm下测定10.空白调零540nm下测定7酶活力单位计算酶活力＝(S×D×1000)/（0.2×30）÷1.5µg/ml(g).min式中：S—测得光吸收在标准曲线上对应的葡萄糖量，mg数；D—酶液或酶粉稀释倍数；1000—mg和µg之间的换算系数；0.2—测定所取酶液量，ml数；30—反应时间，min数；1.5—方法换算系数。8酶活力单位定义及换算8.1本方法酶活定义:在本测定条件下，每分钟水解CMC—Na产生1µg还原糖（以葡萄糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（u）。国际酶活单位的定义:在测定条件下,每分钟水解CMC—Na产生1µmol还原糖（以葡萄糖计）所需酶量定义为一个酶活力单位（IU）。9.2u与国际单位IU的换算关系：1u＝1÷180IU（µmol糖/ml(g).min）180:葡萄糖的分子量