木霉TP100726菌株固体发酵及所产纤维素酶酶学性质的研究

1木霉TP100726菌株固体发酵及所产纤维素酶酶学性质的研究摘要本试验以在木霉TP100726菌株固体发酵基质中加入木糖渣为目的，研究其在其它条件不变的情况下木糖渣对原始配方中稻草的替换，并进一步考察木霉TP100726菌株所产纤维素酶的酶学性质及糖化木糖渣的情况。结果表明，木糖渣可替代20%的稻草粉。纤维素酶的最适温度为50℃，最适pH为5.0，在50℃，pH=5.0时较稳定。以木糖渣为底物，柠檬酸缓冲液，料液比为1:10，温度为50℃，pH5.0时，糖化木糖渣酶活最高，为833U/ml。为利用工业废弃物木糖渣作为原材料发酵生产可发酵糖提供了基础数据。关键字：固体发酵，纤维素酶，木糖渣，酶学性质2AbstractTheexperimentsisinordertojointhexyloseresidueinthesolidfermentationsubstrateofTrichodermaTP100726strains,andstudythexyloseresidueinthecaseofotherconditionsremainunchangedonthereplacementoftheoriginalformulainthestraw,andfurtherinvestigatedtheTrichodermaTP100726straincellulaseproducedbytheenzymaticpropertiesandsaccharificationxyloseresidue.Theresultsshowthatxyloseresiduecanreplace20%ofthestrawpowder.Thecellulase'soptimaltemperatureis50°C,theoptimumpHis5.0,anditismorestableat50°C,pH=5.0.Xyloseresiduesubstrate,citratebuffersolution,solidtoliquidratioof1:10,temperature50°C,pH5.0andthehighestenzymeactivityisachieveto833u/ml.Itprovidesthebasicdataofusexyloseslagasrawmaterialstofermentationproductionoffermentablesugars.Keywords:solidfermentation,celluloseenzyme,xyloseslag,properties31引言1.1纤维素酶纤维素类物质是自然界中资源最为丰富的可再生的生物聚合物之一[1]。如果将天然纤维素降解为可利用的糖类物质,再进一步转化为乙醇、菌体蛋白、气体燃料(如氢气)等物质,对解决当今世界所面临的环境污染、粮食短缺、饲料资源紧张和能源危机等问题具有重大现实意义[2]，而纤维素酶是降解纤维素最有效的生物催化剂[3]。1.1.1纤维素酶的组成纤维素酶(Cullulase)是一种能够将纤维素分解成多糖或单糖的复合酶系，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成[4]。纤维素酶中的外切β-葡聚糖酶（简称C1），降解纤维素分子末端的β-1,4糖苷键，产生纤维二糖；内切β-葡聚糖酶（简称CX），随机地降解纤维素分子内部的β-1,4糖苷键，产生大量具有非还原性末端的小分子纤维素；β-葡萄糖苷酶（简称CB），降解纤维糊精或纤维二糖生成葡萄糖。1.1.2纤维素酶的来源纤维素酶种类繁多，广泛存在于生物体中[5]。植物、动物、微生物体内都能够产生纤维素酶，且其主要来源是微生物。1906年在蜗牛的消化液中首先被人们发现[6]，1945年在微生物中发现，并将纤维素酶应用在工业上[7]。目前工业上用来生产纤维素酶的微生物多为丝状真菌，其中工业产纤维素酶80%来源于木霉属和曲霉属。木霉属中常见有绿色木霉(Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichodermaressiei)、康氏木霉等[8]，曲霉中常见的高产菌株为黑曲霉，青霉属中国内研究较为清楚并用于工业生产的为斜卧青霉[9]。本论文采用的是一株木霉TP100726菌株，它属于一种未知的绿色木霉。1.2木糖渣木糖渣是玉米棒芯经酸水解制取木糖后剩下的纤维残渣，其主要成分为纤维素、半纤维素、木质素，是一种化工原料废弃物，价格低廉[10]。由于已经过稀酸水解，此种纤维素资源结晶度低，更容易被菌体利用和被纤维素酶水解，所以它也是一种优质的纤维素资源。如能将这些纤维质的“废渣”转化利用，将带来很大的经济效益和社会效益。41.3纤维素酶酶学性质pH值和温度是影响纤维素酶活力的重要因素，是酶制剂应用中的主要参数[11]。研究纤维素酶的最适温度及热稳定性、最适pH及酸碱稳定性，有利于提高酶的催化效率，即提高酶促反应速度。本实验即要对工业菌株所产纤维素酶的最适温度、最适pH、温度稳定性、酸碱稳定性及糖化木糖渣的情况进行研究。1.4研究内容及目的本试验固体发酵产纤维素酶所采用的菌株是一株木霉TP100726号菌株，本研究拟用工业固体废料木糖渣部分替代木霉TP100726号菌株固体发酵基质中的稻草，并研究固体基质替代后固体发酵所产纤维素酶的酶学性质及其水解木糖渣的最适反应条件。具体包括研究固体基质替代后固体发酵所产纤维素酶的最适温度、最适pH、温度稳定性、酸碱稳定性及糖化木糖渣的情况，为探索合理利用木糖渣，使工业废料变废为宝提供基础理论依据。52木霉TP100726号菌株固体发酵培养基的优化2.1试验材料2.1.1试验菌种木霉TP100726号菌株，实验室培养。2.1.2发酵原料来源木糖渣：由河南濮阳研光鹏程生物制品有限公司提供。半纤维素23.5%、纤维素21.3%、木质素6.70%、其它48.50%[12~14]。麸皮：市场购置，粉碎至40~60目，备用。稻草粉：市场购买南阳豆粉：市场购买2.1.3试验试剂及配制（1）试验试剂试验所用试剂见表2.1表2.1试验所用试剂试剂纯度生产厂家磷酸氢二钾A.R吴江市天源化工有限公司氢氧化钠A.R郑州派尼化学试剂厂生物传感仪标准液B.R山东省科学院生物研究所3,5-二硝基水杨酸A.R国药集团化学试剂有限公司酒石酸钾钠A.R天津市凯通化学试剂有限公司无水亚硫酸钠A.R天津市永大化学试剂开发中心苯酚A.R天津市风船化学试剂科技有限公司硫酸铵A.R北京奥博星生物科技有限公司（2）试验试剂配制[15~18]6DNS溶液（3，5-二硝基水杨酸）：称取3,5-二硝基水杨酸5g，置于300ml水中，逐渐加入NaOH5g,于45℃水浴中搅拌溶解，再加入酒石酸钾钠100g，苯酚0.5g，无水亚硫酸钠2.5g，定容至500ml，一周后使用。0.05M柠檬酸缓冲液：A液：称7.56504g柠檬酸，溶于720ml去离子水中。B液：称17.646g柠檬酸钠，溶于1200ml去离子水中。A液和B液慢慢混合，制成pH=5的缓冲液。CMC试剂的配制：称取1g羧甲基纤维素钠于100ml柠檬酸缓冲液中，待溶解后置于冰箱中保存。1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取经80℃~100℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，充分混匀后，于4℃冰箱保存备用。2.1.4试验仪器试验所用仪器如表2.2所示：表2.2试验所用仪器名称型号生产厂家生物传感分析仪SBA-40c山东省科学院生物研究所电热恒温培养箱DH4000B型天津市泰斯特仪器有限公司UV-VIS分光光度计UV---1700SHIMADZUCORPORATION灭菌锅YXQ-LS-30SII上海博讯实业有限公司电子天平(普通)YP601N上海精密科学仪器有限公司冷藏陈列柜LSC-269CW星星集团有限公司纯水仪Synergy®UV美国Millipore公司冰箱BCD-207AK合肥美菱股份有限公司烘箱DV-600YAMATOSCIENTIFICCO，LTD.电热恒温水浴锅HSQ-3上海智诚分析仪器制造有限公司pH仪RHS-3C上海鹏顺科学仪器有限公司恒温振荡摇床智诚ZHWY-103D上海智诚分析仪器制造有限公司离心机TGL－16B上海安亭科技仪器厂7-80°C低温冰箱MDF-U4086S日本SANYO2.1.5培养基活化培养基：PDA培养基：取200g去皮洗净的土豆切成小块，加水煮烂后滤出上清后定容至1000ml，加入2%葡萄糖，2%琼脂，107℃灭菌20min。基础发酵培养基：60%麸皮，40%稻草粉，3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4固液配比:1:1.5，装料比:每250ml锥形瓶加6.0g固体成分。121℃高压蒸汽灭菌25min，备用。2.1.6粗酶液的制备当菌株培养一定天数后，用柠檬酸缓冲液按1:10的固液比浸提3小时，然后4000r/min离心10min，取上清即为粗酶液。2.2试验方法2.2.1木霉TP100726菌株固体发酵2.2.1.1配制培养基原始固体配比:60%麸皮，40%稻草粉，无机盐溶液:3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4发酵培养基：固体基质按正交表（表2.3）中组合进行配制，不足6.0g的用稻草来补。无机离子组成：3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4固液配比:1:1.5，装料比:每250ml锥形瓶加6.0g固体成分2.2.1.2正交试验（1）设计正交表表2.3正交实验各因素与水平因素麸皮木糖渣豆粉11（20%）1（10%）1（0%）22（40%）2（20%）2（1%）33（60%）3（30%）3（2%）（2）在超净工作台里，将培养基放入，紫外灭菌15min，然后无菌操作接入一环孢子，放于28℃恒温培养箱中培养。8（3）在培养过程中，从第五天开始，每隔24h取发酵基质一瓶，加入60ml缓冲液（固体装料质量：缓冲液体积=1:10），浸提3-5h（4）取浸提液于离心管中，4000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。（5）根据2.2.4中酶活测定方法测定粗酶液的FPA酶活和CMC酶活。2.2.2观察2.2.2.1表面观察用PDA培养基活化保存的菌株，并在培养过程中观察木霉TP100726菌株菌落形态随时间变化的情况。2.2.2.4霉菌形态观察用乳酸石碳酸棉兰染色液对木霉TP100726菌株进行染色并观察，首先于洁净载玻片上滴一滴乳酸碳酸棉兰染色液，再用解剖针从霉菌菌落的边缘取少量带有孢子的菌丝置于染色液中。细心地将菌丝挑散开，小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。最后置显微镜下进行观察。2.2.3制作葡萄糖标准曲线取5支试管，按表2.4加入1000μg/ml标准葡萄糖液及去离子水，得到从100μg/mL~800μg/ml的标准管。分别吸取上述不同浓度的葡萄糖溶液1ml，DNS试剂1ml，混合均匀，沸水浴加热7min，取出，用水冷却，用去离子水定容至10ml，置分光光度计上540nm处测定光密度值，以空白管(0管)做对照。表2.4标准葡萄糖液配比管号1000μg/ml葡萄糖（ml）H2O（ml）葡萄糖浓度C（g/L）001001190.12280.23460.44640.65820.82.2.4酶活测定方法[19~21]FPA测定：取0.5ml适当稀释的粗酶液，加入pH5.0的0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液0.5ml，混匀后加入1×6cm新华滤纸条，空白对照中加入1mlDNS，于50℃保温91h（先预热5min），然后加入1mlDNS沸水浴7min，流水冷却至室温，用蒸馏水定容至10ml，在540nm处测定OD值，根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据葡萄糖生成量计算酶活。CMC酶活测定：取0.5ml适当稀释粗酶液，加入0.5ml由pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制而成的1%CMC-缓冲液，空白对照中加入1mlDNS，50℃保温30min（先预热5min），然后加入1mlDNS沸水浴7min，流水冷却至室温，定容至10