木聚糖酶的基因来源及研究进展

木聚糖酶的基因来源及研究进展1木聚糖酶介绍木聚糖是半纤维素的一种组成部分，是半纤维素中含量最丰富的一种，主要成分是D-木糖，是除纤维素之外自然界最为丰富的多糖，也是自然界中获得的可再生资源之一，几乎所有植物都含有木聚糖，它是细胞壁的组成成分，占细胞干重的15～30%。木聚糖是一种结构复杂的非均一聚糖，主链骨架是由多个D-木糖基通过β-1，4糖昔键相连而成。木聚糖的完全降解需要多种水解酶的参与而共同完成。木聚糖酶是一类将木聚糖降解为低聚糖和木糖的一组酶系，属于水解酶类。广义上包括内切-β-1,4-木聚糖酶、外切-β-1,4-木聚糖酶和β-木二糖苷酶。内切-β-1,4-木聚糖酶优先在不同位点上作用于木聚糖和长链木寡糖，从β-1,4-木聚糖主链的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。外切-β-1,4-木聚糖酶作用于木聚糖和木寡糖的非还原端，产物为木糖。β-木二糖苷酶通过切割木寡糖末端而释放木糖残基。狭义上的木聚糖酶仅指内切-β-1,4-木聚糖酶。2木聚糖酶的不同来源微生物来源的木聚糖酶的分子量在8～145KDa，它们只含一个亚基。一般来说，分子量小于30KDa的木聚糖酶为碱性木聚糖酶，它们通常含有182～234个氨基酸残基；而分子量大于30KDa的木聚糖酶为酸性木聚糖酶，它们通常含有269～809个氨基酸残基。通常细菌可产生两种木聚糖酶，即低分子量碱性木聚糖酶和高分子量的酸性木聚糖酶，但真菌一般产生低分子量碱性木聚糖酶。据资料报道，产该酶的微生物有几十个属，一百多个种，主要来源于细菌和真菌。目前，已从20余种细菌菌株、16种真菌、3种酵母以及8种放线菌中分离出相应的木聚糖酶。2.1细菌来源的木聚糖酶目前对来源于细菌的木聚糖酶的酶学性质，研究得比较清楚，芽孢杆菌的研究多集中在环状芽孢杆菌（BacilluscirculansD1），短小芽孢杆菌(BacilluspumilusASH)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans）上。芽孢杆菌产生的木聚糖酶的最适pH在5.5～9.0，多数为pH6.0；最适反应温度在50～75℃，多数为70℃，分子量集中在16～56KDa，多数为24KDa。Irwin等(1994)对嗜热单孢菌的木聚糖酶特性进行了分析，分子量为32KDa，在75℃，18h下酶活力为96%。某些放线菌也能产生木聚糖酶(Ethier等，1994)。表1近年细菌木聚糖酶的研究菌种是否工程菌发酵方式酶活参考文献BacilluscirculansD1否液态深层发酵8.4U／mLBocchini等（2005）BacilluspumilusASH否固态发酵7087U／g（干物质）Battan等（2006）Bacillussubtilis否液态深层发酵3194.25U／mLDeepak等（2008）BacillussubtilisASH否固态发酵8964U／g（干物质）Sanghi等（2009）E．coli是液态深层发酵2122.5U／mLRusli等（2009）2.2真菌来源的木聚糖酶2.2.1木霉木聚糖酶特性木霉（Trichodermaharzianum）是一类工业上生产纤维素酶的主要真菌，同时一些木霉也能产生各种不同的木聚糖酶。Koyer等(1991)从里氏木霉中纯化得到两种木聚糖酶，木聚糖酶A的分子量为21.5KDa，分解产物为木二糖和木三糖；木聚糖酶B分子量为33KDa，分解产物为木二糖和木糖。木二糖能抑制木聚搪酶B的酶活，而对木聚糖酶A无此效应。里氏木霉制备的木聚糖酶，水解植物半纤维素后，分离提纯该酶解液，用HCLP法分析其组成为；木糖3.4%、木二糖37.9%、木三糖18.5%、木四糖6.5%、木五糖6.5%，其它27.2%(徐勇等，2001)。植物半纤维素经低聚木糖酶的定向酶解后分离提纯的主要成分为木二糖和木三糖。2.2.2曲霉木聚糖酶特性Kimwa等(1995)从曲霉（AspergillusSojae）中得到了内切β-1,4一木聚糖酶的两种同工酶，分子量分别为32.7KDa和35KDa，等电点分别为3.50和3.75，这两种酶活性能明显被Mn2+和EDTA所抑制。Femandez等(1995)发现，构巢曲霉在以木聚糖为碳源时至少可分泌三种内切β一木聚糖酶：X22、X24、和X34，分子量分别为22、24和34KDa，其中X22是中性酶，其余两种为酸性酶。此酶对木聚糖有很高的专一性，是一种非脱支型木聚糖酶，与黑曲霉木聚糖酶近似，但后者分子量较小(28KDa)。注：AspergillusnigerXY-1、LBP326、SS7黑曲霉，AspergillusterreusMTCC8661土曲霉，AspergillusfoetidusMTCC4898臭曲霉，Penicilliumcanescens变灰青霉菌，Thermonyceslanuginosus195嗜热真菌，TrichodermaharzianumKSR-2木霉，Burkholderiasp.DMAX伯克霍尔德氏菌此外，裂褶菌（Schizophyllumcommune），固体培养产木聚糖酶酶活2700U/g，钧木霉（Trichodermahamatum）产木聚糖酶酶活7000U/g，嗜热拟青霉（PaecilomycesthermophilaT18）通过小麦秸秆固体发酵产酶酶活18580U/g，里氏木霉（Trichodermareesei），产生的木聚糖酶的最大酶活为3350U/ml，绿色木霉：产生三种木聚糖酶XI、XII和XIII，它们最适反应温度分别为60℃、60℃、50℃，最适反应pH分别为5.5、5.0、4.5。2.3毕赤酵母表达的木聚糖酶2.3.1表达细菌来源的木聚糖酶芽孢杆菌Bacillussp.NG-27耐热耐碱木聚糖酶AFO15445最适pH8.5，最适温度70℃，最高酶活：426U/ml，成熟蛋白基因大小、编码氨基酸数目和分子量大小都未知。表达菌株为GS115，表达载体是pHBM905。2.3.2表达真菌来源的木聚糖酶（1）曲霉，产生高稳定性木聚糖酶，最适pH5.0，最适温度60℃，比活856U/mg，成熟蛋白基因555bp，编码185个氨基酸，分子量约26kDa，表达菌株X-33，表达载体pGAP。（2）黑曲霉N402，产生耐高温木聚糖酶xyl，最适pH2.5，最适温度50℃，比活未知，成熟蛋白基因636bp，成熟蛋白基因编码212个氨基酸，分子量约23kDa，表达菌株GS115\SMD1168，表达载体pGAPZa。（3）里氏木霉RutC-30，产生酸性木聚糖酶XYNII，最适pH5.0，最适温度60℃，比活856U/mg，成熟蛋白基因669bp，成熟蛋白基因编码223个氨基酸，分子量为24.5kDa，表达菌株GS115，表达载体pPIC9K。（4）链霉菌（StreptomycesolivaceoviridisA1），最适pH4.6，最适温度50℃，比活未知，成熟蛋白基因576bp，成熟蛋白基因编码191个氨基酸，分子量约23.0kDa。（5）橄榄绿链霉菌（StreptomycesolivaceoviridisXYNB），最适pH5.6，最适温度60℃，最高酶活10000U/ml，比活1179.6U/mg，成熟蛋白基因576bp，成熟蛋白基因编码191个氨基酸，分子量约23kDa，表达菌株GS115，表达载体pPIC9a。（6）瓶霉属：phialophorasp.J88高温酸性木聚糖酶XYN10J88最适pH：4.0最适温度：70比活：350.6U/mg成熟蛋白基因：1137bp成熟蛋白基因编码379个氨基酸分子量为：40.0kDa，表达菌株GS115，表达载体pPIC9。3木聚糖酶的应用3.1木聚糖酶在饲料上的应用（1）木聚糖酶降解木聚糖，降低肠道食糜黏度，破坏植物细胞壁结构，消除其抗营养作用，改善动物生产性能。降低饲料用粮中的非淀粉多糖，提高饲料代谢能，促进养分吸收。（2）消除木聚糖对内源酶的抑制，防止消化器官代偿性肥大。（3）木聚糖降解后生成大量功能性寡糖（木二糖、木三糖等），改善肠道微生物区系，有利于动物健康。（4）增加营养物质的吸收利用，减少粪便排放，保护环境，同时减少粪便有机物质分解产生的有害气体对畜禽的刺激，减少呼吸道疾病的发生。（5）减少饲料原料品质变异造成的饲料产品质量波动，稳定产品质量，减少投诉。（6）拓宽饲料原料使用范围，加大非常规饲料如麸皮、次粉、米糠等在饲料中的用量，降低饲料配方成本。增强饲料和养殖企业赢利能力。在饲料制粒过程中有一个短暂的高温过程（温度一般在75～93℃），一般木聚糖酶在此温度下会大幅度丧失活性，因此能在饲料中真正推广的木聚糖酶必须具有良好的热稳定性。一般来说，非淀粉多糖(NSP)酶在75℃时是稳定的。80℃时酶活损失50%以上(PilipLobo等，1998)；另一方面饲料中木聚糖酶最终的作用场所是动物正常体温(37℃)的胃肠道中，木聚糖酶必须在常温下具有较高的活性。近年来，已从嗜温微生物中发现了多种耐高温木聚糖酶，对它们的结构与热稳定性的研究将为木聚糖酶基因的分子改造提供理论依据。3.2在食品上的应用小麦面食。木聚糖酶在食品中的应用主要是在小麦面粉的改良方面。小麦面粉中的戊聚糖含量虽少，但却对面团的流变性质和面食品质有着显著影响。烘焙面包时，在面粉中加入木聚糖酶可以改善面粉的切分、搓团和成型等机械加工性能,增加面包的体积和比容，改善面包心的弹性、硬度和柔软性，延缓面包的老化。同样，木聚糖酶还可以应用在馒头、蛋糕等其他小麦食品中，通过面粉持水性的改善和面筋网络结构的优化来提高其品质，并可延长其货架寿命。果蔬加工。果蔬细胞壁是由果胶质、纤维素和木聚糖等半纤维素组成的网状结构，可阻止细胞内容物的渗出。因此，要将新鲜水果蔬菜加工成果蔬汁，关键是彻底水解果胶。过去，人们认为只要有一定的果胶酶即可水解果胶，提高出汁率，但结果并不理想。后来发现将木聚糖酶与纤维素酶和果胶酶合理搭配就可在温和的条件下破坏果蔬的细胞结构，提高出汁率。同时，由于该复合酶分解了果蔬中的果胶和半纤维素等物质，降低了果汁的粘度，从而也就加快了果汁的流出，使得压榨时间缩短，提高了工厂的生产效率。此外，部分木聚糖等半纤维素在酶的作用下分解成水溶物，这也提高了饮料中可溶性固形物的含量。酿酒。在啤酒酿造中，木聚糖酶主要是应用在麦芽汁的生产上。生产中由于原料含β-葡聚糖和木聚糖较多，使得麦汁粘度高而难以过滤,并引起啤酒混浊、啤酒滤膜堵塞等问题。在麦芽汁制备过程中加入木聚糖酶后，酶不但能通过降解木聚糖破坏植物细胞壁，使细胞内容物充分释放出来与麦芽中的淀粉酶和蛋白酶等水解酶充分接触而消化，缩短糖化时间，而且还可以水解水溶性木聚糖，降低麦汁粘度，从而有效地提高了麦芽汁的过滤速度。木聚糖酶和β-葡聚糖酶协同作用处理效果更佳。在白酒生产中，木聚糖酶的主要作用是和纤维素酶等其他多糖水解酶协同破坏原料细胞的结构。这是因为白酒是以谷物的粉碎颗粒为原料进行固体发酵而酿造的。因此，只有彻底破坏纤维素、半纤维素、果胶、蛋白质等组分对淀粉颗粒的屏蔽和保护作用，才能充分淀粉酶的糖化作用。木聚糖酶的活性和出酒率密切相关。3.3在造纸上的应用制浆造纸向来是环境污染的主要源头，其排放的工业废水尤其是漂白工段的废水含有大量有毒和强致癌致畸的化学物质，严重危害了生态环境。1986年，在国际造纸工艺生物研讨会上，芬兰科学家Viikari等人首次报道用木聚糖酶预处理松木和桦木KP浆可降低漂氯用量、提高白度。这一发现极大地鼓舞了造纸工作者，同时带动了全球范围内生物造纸技术的研究和发展，并取得了重大成果。在其后的木聚糖酶研究中，人们发现该酶不仅在纸浆漂白上效果显著，而且在其他方面如制浆、废纸脱墨和纤维改性等也有不俗的表现。