提取RNA

一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-TimePCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总rna的提取过程中，注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNaseI进行消化(因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂)。二、DNAseI消化样品RNA中的DNA用DNaseI消化DNA组份加量模板(RNA)10ugRNaseInhibitor4ulDNaseIbuffer10ulDNaseI10ulDEPC处理H2O至100ul混匀，37℃90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1.1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1)称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml的DEPC水，放微波炉里溶化。2)待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。2.取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。3.120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。4.RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。四.RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例)组份加量(20ul体系)加量(40ul体系)模板(RNA)0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整)3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物)2.0ul4.0ulDEPC处理H2O至12.5ul至25ul混匀，70℃5min，立即冰浴5*buffer4.0ul8.0uldNTP(10mM)2.0ul4.0ulRNaseInhibitor0.5ul1.0ul混匀，37℃5minM-MLV1.0ul2.0ul42℃60min，70℃10min反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求1)随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2)Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。3)特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。做RealTimePCR时，用于SYBRGreenI/EvaGreen法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。五、cDNA与引物质量检测取0.2ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCRTaqMix10ul;加入正反向引物各0.5ul(引物浓度10uM)，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管补加水至20ul。组份加量2×PCRTaqMix10ul10uMPrimerFW0.5ul10uMPrimerRV0.5ulTemplateDNA1ulddH2O混匀至20ul混匀，置于TP600PCR仪中。95℃5min;95℃15s，60℃35s，40cycles;72℃5min;4℃pause。取扩增产物各8μl，DL2000分子量标准5μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察。选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。七、定量PCR检测：取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入2×qPCRTaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25ul。组份加量模板(cDNA)/ddH2O1.0ul10uM引物F/R0.5ul2×qPCRMix12.5ulddH2O11.0ul混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s(荧光检测)，40cycles。荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。八、扩增曲线和溶解曲线溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质;如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-TimePCR中很难避免;若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。在溶解曲线中出现双峰有三种可能：①引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物;②在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰(只在引物跨内含子时存在)，出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA;③扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。九、表达差异的计算方法绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。2-△△CT方法的推导(详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量)补充：在DNaseI消化样品RNA中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：消化后总体积10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200ulDEPC水。1.向离心管中加入等体积氯仿(约300ul)，剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。4℃14000rpm离心8min，取上清(约250ul)。2.加入1/10体积的NaAC(3M)(约25ul)和预冷的等体积异丙醇(约280ul)，-20℃放置20min。3.4℃14000rpm离心15min，去上清，注意不要触到沉淀。4.加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm离心3min，去上清。5.瞬时离心，用200ul(或10ul)的枪头小心吸去离心管底的残存液态(勿吸到管底的沉淀)。6.把离心管放置于超净台晾至约5-10分钟(勿完全干燥，否则很难溶)。加入30~50μl的无RNase的水，静止1min后，振荡30sec，瞬时离心。7.将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20℃保存。1.关于Trizol的购买：目前市面上买的大多是100ml装的，比较出名的是Invitrogen公司的Trizol，100ml原装的据说要1200大洋以上，不过有一种据说香港分装的，只需600元，但是相对国产品牌三四百元的价格还是贵了一些。国产很多公司都有类似的Trizol试剂，价格大多三百多元，成分都差不多，可以说都是invitrogen的山寨产品。比如我用的是北京一家公司的，四百多，做出来也还不错。Takara有一款专门提取smallRNA的trizol，好像贵一些。2.关于配套试剂：Trizol法提取RNA是要用到氯仿、异丙醇和乙醇的。氯仿现在是违禁品，不大好买（我们学校试剂科现在不卖），所以买的时候要让试剂上给送，一般他们都能免费给送。氯仿遇光易分解，试剂商给你的时候应该是遮光的。异丙醇虽然没有特殊说明，但我查的据说也是最好避光保存，不过这种试剂都是棕色瓶子，能遮蔽大部分的光线了。3.关于实验时的防护：RNA很容易降解，所以实验时一般都要求口罩帽子的，避免组织的污染。不过以我的经验，好像内源性的RNA酶才是最主要的，也就是组织内本身的RNA酶。开始我是很小心，口罩手套帽子的，但是提取出来发现还是降解了，后来有经验了，即使组织掉在地上，拿回去继续提也没问题（前提是不能化冻）。所以最最重要的是组织在液氮研磨成粉末并加Trizol之前不能化冻，这也是fast200法提取效果不好的原因（fast200法一般不用液氮研磨）。4.关于液氮研磨：万事开头难，液氮研磨是最开始的步骤，也是最辛苦的步骤。很多女孩子都怕液氮，毕竟是零下近200度的东西，当然不是闹着玩的。不过只要小心操作，一般没啥问题，我提了一个多月的RNA，对液氮是很亲切了，呵呵。我是找了一个保温杯，倒出一些液氮，然后再往研钵里倒。研磨的时候多加几次液氮，组织会慢慢变脆，就会好研一些，对于一些含水量比较大，很硬的组织，我是准备了刀片，切成小块后再研磨，一定研磨充分，不要求研磨成奶粉状，但至少得看不到明显的颗粒，这样Trizol才能充分和组织接触，快速裂解组织，也能防止组织的降解（Trizol内含RNA酶抑制剂）。5.关于组织量：研磨前最后称一下组织的重量，毕竟1ml的Trizol最多只能裂解100mg的组织。Trizol里面是含有RNA酶抑制剂的，如果组织过量，Trizol无法完全浸润组织无法完全裂解组织，多余组织内的RNA酶等物质会导致RNA的降解。这是RNA降解的很重要的原因。6.关于提取步骤：标准Trizol提取步骤为液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--离心--加入氯丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心。因为提取的组织，在加入Trizol后增加了一步简短的离心，可以帮助去掉一些无法降解的组织，比如纤维和杂质之类，然后取上清再加入氯仿，可以帮助提高氯仿的效率。然后就是在加入Trizol后，可以将裂解液放到-80冻存半小时以上，据说冻融过程中可以再次帮助更加充分的裂解细胞，分离蛋白和RNA。我试了一下，的确有效果。7.关于个步骤的时间：标准的时间是a.液氮研磨（没时间要求，只要组织不化就好,我一般一个组织十分钟左右，女孩子可能时间长一些，毕竟体力活）b.