摸索双水相萃取酵母蔗糖酶的条件实验报告

生物制药工艺学实验报告——摸索双水相萃取酵母蔗糖酶的条件一、实验目的了解双水相萃取的原理；掌握蔗糖酶比活力测定的原理和方法。二、实验材料试剂：0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.4），1mol/LNaOH溶液，5%蔗糖溶液，DNS溶液，1mg/mL葡萄糖标准溶液；固体试剂：PEG1500,PEG6000,硫酸铵仪器：低速离心机，可见分光光度计，水浴锅。三、实验原理双水相萃取：某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相系统。相图：两水相的形成条件和定量关系，常用相图来表示，它是一条双结点线。影响分配系数的主要因素：①聚合物的相对分子质量在聚合物浓度不变的前提下，当聚合物相对分子质量降低时，其疏水性下降，亲水性蛋白质易分配于富含该聚合物的相中。②聚合物的浓度当双水相系统的总浓度增大时，两相性质的差别增大，蛋白质趋向一侧分配。③盐类的影响盐的浓度影响蛋白质疏水性。蔗糖酶活力测定的原理蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖水解为D－葡萄糖和D－果糖。葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5－二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比关系；蔗糖酶的活力通过其水解产生的还原糖量来反映。四、实验步骤1、研磨法破碎酵母细胞称6g活性干酵母粉于研钵中，用捣杵研磨，破碎酵母细胞（至粉末状），再加入30mL0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.4），继续研磨（成匀浆状）。吸取4mL酵母细胞匀浆液分配于2个dorf管中，5000rpm离心20min，留取上清液（标记为“粗酶液”）。将剩余匀浆液平均分为2份，每份约12mL。单因素实验考察PEG浓度对蔗糖酶分配的影响条件：硫酸铵浓度为15%，PEG6000PEG6000浓度为：16%，20%2.双水相萃取蔗糖酶（双水相体系重量为40g）先称量干净烧杯的重量，去皮，再将一份酵母细胞匀浆液倒入烧杯中，称量匀浆液的重量；在烧杯中，再加入相应质量的PEG和硫酸铵，补充蒸馏水至40g；搅拌使PEG和硫酸铵溶解，并充分搅拌5min，5000rpm离心20min，加速两相分开；在离心管上标明“萃取组（上）”和“萃取组（下）”。测量上、下相的体积，暂存于烧杯中，并用保鲜膜蒙上放于冰箱中。3.蔗糖酶活力测定酶解反应体系试剂(均35度预热)粗酶液组萃取组测定组对照组测定组对照组酶液(mL)0.50.51.01.01NNaOH(mL)－0.5－0.55%蔗糖(mL)2.02.02.02.035度水浴10min1NNaOH(mL)0.5－0.5－DNS法测定体系中还原糖的含量试剂粗酶液组萃取组测定组对照组测定组对照组水解液（mL）0.10.10.10.1DNS液（mL）1.01.01.01.0沸水浴5min，自来水冷却，补充10mL蒸馏水，以对照组调零，记录测定组OD540nm。4.制作葡萄糖标准曲线编号1mg/mL标准葡萄糖溶液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）000.51.010.050.451.020.10.41.030.150.351.040.20.31.050.250.251.060.30.21.070.350.151.0沸水浴5min，自来水冷却，补充10mL蒸馏水，以0号管调零，测定各组的OD540nm葡萄糖质量（mg）x吸光值y00.0020.050.0180.1-0.090.150.0480.20.1050.250.1150.30.1150.350.207葡萄糖标准曲线y=0.6171x-0.043-0.15-0.1-0.0500.050.10.150.20.2500.050.10.150.20.250.30.350.4系列1线性(系列1)5.蛋白质含量测定试剂空白组粗酶液组萃取组相应组别的溶液（mL）—0.10.1蒸馏水（mL）0.1——考马斯亮蓝G-250（mL）555混匀，然后以空白组调零，测定各组OD595nm6.制作蛋白质标准曲线管号0123456标准牛血清白蛋白溶液（1.0mg/mL）00.010.020.030.040.050.060.1M磷酸钠缓冲液pH7.4（mL）0.100.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝G-250（mL）5.05.05.05.05.05.05.0混匀，10min内以0号试管为对照，测定OD595nm蛋白质浓度（mg/ml)x吸光值y000.10.0490.20.1460.30.1050.40.2940.5-0.3010.6-0.301五、实验结果①计算蔗糖酶的活力酶解反应体系中还原糖的质量(葡萄糖标准曲线x=1.6204y+0.07)（酶活力（U/mL）＝还原糖的质量（mg）÷0.1（mL）×酶解反应体系的体积（mL）÷酶液的体积（mL））条件酶液体积(ml)OD540值葡萄糖质量(mg)酶活力(U/ml)粗酶液——132.393.94236.57萃取组20%PEG上相120.7481.2844.87下相122.2643.74130.8516%PEG上相101.8123.01105.22下相142.083.44120.42②计算蛋白质的质量（蛋质标准曲线x=1.55y+0.016）条件OD595值蛋白质的浓度（mg/mL)粗酶液——2.7744.32萃取组20&PEG上相0.2370.38下相2.1213.3016%PEG上相4.767.39下相2.123.30③计算比活力比活力=酶活力（U/mL)÷蛋白质浓度（mg/mL）条件酶活力（U/ml)蛋白质浓度（mg/mL)比活力粗酶液——236.574.3254.82萃取组20&PEG上相44.870.38117.20下相130.853.3039.6116%PEG上相105.227.3914.23下相120.423.3036.47④计算纯化倍数和回收率纯化倍数=萃取相的比活力÷粗酶液的比活力回收率=萃取相的酶含量÷粗酶液的酶含量酶含量=酶活力（u/mL）×酶液体积（mL）组别酶液体积（mL）比活力酶含量纯化倍数回收率粗酶液1354.823075.41————萃取组20&PEG上相12117.20538.442.140.18下相1239.611570.200.720.5116%PEG上相1014.231052.200.260.34下相1436.471685.880.670.55