枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究

枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究摘要：利用单因素法对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的培养基成分进行优化，确定发酵培养基各成分最适宜配比。最后确定了该菌株的最适发酵培养基配方为(g/100mL):棉籽饼粉3.0,酵母浸粉1.75,麦芽糊精10,柠檬酸钠0.13,CaCl20.13。K2HPO41.0;最适摇瓶发酵条件为:接种量2%,装液量50mL/250mL,摇床转速200r/min,34℃,发酵54h,碱性蛋白酶的发酵单位可达1648.8u/mL。此外,还进行了5L罐放大实验,在5L罐所确定的最适工艺条件下,发酵单位可达520.2u/mL。关键词：碱性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；发酵；培养基引言碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,主要应用于生产加酶洗涤[1],另外,在制革、丝绸、医药、食品、饲料和生物化学试剂等领域也有应用。我国在20世纪70年代初期就成功开发了碱性蛋白酶,并实现了工业化生产[2]。目前,我国用于生产的菌种为国内学者自行筛选诱变的菌株———枯草芽孢杆菌,其发酵单位在10000u/mL,与国外先进水平相差甚远[3]。本实验所采用的产碱性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌,其实验发酵单位为22000u/mL,与国外大型酶制剂公司所报道的生产水平30000u/mL相差较大[4]。本实验对该菌株的发酵培养基利用单因素实验确定其基本成分，选择出适合该菌株发酵的最适培养基，从而使其酶活有一定的增长,为其工业化生产奠定基础。1材料与方法1.1菌株枯草芽孢杆菌(Baci11ussubti1is)。1.2试剂及仪器酪氨酸、福林酚试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素;棉籽饼粉;酵母浸粉;麦芽糊精;柠檬酸钠;CaCl2;K2HPO4;KCl由实验室提供。pH计、722分光光度计、恒温水浴锅、离心机。1.3培养基种子培养基(g/L)：胰蛋白胨5、葡萄糖10、酵母浸粉5、K2HPO418,pH值自然，105℃蒸气灭菌20min；摇瓶培养基（g/L）：酵母浸粉0.875、麦芽糊精5、柠檬酸钠0.15、KCl0.46、CaCl20.15、K2HPO40.5，pH值自然，105℃蒸气灭菌20min。发酵培养基(g/L)：酵母浸粉5、葡萄糖5、麦芽糊精15、柠檬酸钠5、KCl8.5、CaCl25、K2HPO43.5，pH值自然，105℃蒸气灭菌20min。1.4方法1.4.1碱性蛋白酶活力的测定取发酵液于4000r/min离心20min取上清液，采用Folin酚法测定蛋白酶活力[5]。酶活力单位定义为：在温度55℃pH10.0条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位，以U表示。A680*K*n*4样品的酶活力(U/ml)＝———————————10式中：A--样品平行实验的平均吸光度K--吸光常数4--反应试剂的总体积(ml)10--反应时间(min)n--稀释倍数1.4.2不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶粗酶的影响无机盐分别选用0.02%Na2HPO4、0.02%KCl、0.02%K2HPO4、0.02%NaCl，以不加无机盐为对照组，在其他条件不变的情况下，以酶活力为指标，确定最佳无机盐。2结果与分析2.1碱性蛋白酶酶活力测定标准曲线图1福林试剂法标准曲线y=89.317x-2.048R2=0.9935-10010203040506000.10.20.30.40.50.6OD值酪氨酸浓度（ug/ml）碱性蛋白酶测定结果如图1所示。由该曲线求得线性回归方程为：Y=89.317X-2.048，R2=0.9935。本法在酪氨酸浓度0～60μg/ml范围内有良好的线性关系。2.2不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶粗酶酶活力的影响图2无机盐对芽孢杆菌产碱性蛋白酶的影响0500100015002000K2HPO4Na2HPO4KCl无CaCl2MgSO4FeSO4酶活力（U/ml）由图2分析：K2HPO4与Na2HPO4相比较，HPO4~一定时，Na比K对芽孢杆菌产酶较好。K2HPO4与KCl相比较，K一定时，HPO4~比Cl~对芽孢杆菌产酶有促进作用。KCl与无CaCl2相比较，对芽孢杆菌产酶无影响。所述，KCl有利于芽孢杆菌产碱性蛋白酶。2.35L罐发酵过程曲线在摇瓶实验基础上,进行了5L罐中的放大实验。装料系数:017,接种量:4%,温度:30℃,转速:300r/min。对发酵过程中的菌体PH、粗酶液中酶活力及发酵液中OD600进行了测定,所绘发酵曲线如图3所示。5L罐发酵单位最高可达520.2u/mL。1416182022242628303234360.00.20.40.60.81.06850100150200250300350400450500550OD600(×5)时间/hPH酶活(u/ml)图3发酵罐过程曲线由图3分析：发酵到14小时后取发酵原液测出其OD600、酶活和PH都很高。15-21h，没货和OD600都迅速减小，PH也在下降，这段时间中可能是由于换滤膜而引起了染菌或是溶氧造成的结果。22-27h，酶活一直在持续增加，PH相对减小的比较缓慢，OD600在稳定一段时间后突然增加。28-35h，酶活开始持续降低，PH和OD600也在跟着减小。3结论采用枯草芽孢杆菌为发酵菌株，用单因素试验确定了最佳培养基配方和最适发酵条件，最后得到最佳培养基为（g/L）棉籽饼粉3.0,酵母浸粉1.75,麦芽糊精10,柠檬酸钠0.13,CaCl20.13，K2HPO41.0，最佳培养条件为接种量4%，在250ml的三角瓶中，装液量为50ml发酵54h，碱性蛋白酶酶活力可达1670U/ml。本实验采用5L发酵罐、装液量为3L,研究了芽孢杆菌产碱性蛋白酶的扩大培养条件。在摇瓶水平的基础上，结合本实验室5L小型发酵罐具体情况和相关文献，以菌体PH、粗酶液中酶活力及发酵液中OD600，考察它们对碱性蛋白酶产率的影响。结果表明，较优发酵条件是，菌体PH6.09、粗酶液中酶活力520.2U/mL和发酵液中OD6000.371U/ml。参考文献：[1]华章熙,徐清1洗涤剂酶应用手册[M]1北京:中国轻工业出版社学报,1999139[2]薛林贵1我国碱性蛋白酶的应用及研究进展[J]1微生物学通报,1997,24(6):370～371[3]杜连祥1工业微生物学实验技术[M]1天津:天津科学技术出版社学报,1992,274[4]肖怀秋,林亲录,李玉珍,等.中性蛋白酶芽孢杆菌BX-4产酶条件及部分酶学性质[J].食品与生物技术学报,2005,24(4):42-46.[5]王福荣,郭风茹,田栖静,等.QB/T1803—1993工业酶制剂通用试验方法[S].天津:轻工业部食品工业学报,1993.