细菌的人工培养

结晶紫1min卢戈碘1min95%乙醇30s稀释复红30s革兰染色革兰染色结果油镜下模式图×1000二、细菌的人工培养根据细菌的生理需要和繁殖规律，用人工方法为细菌提供营养物质和适宜的环境条件，使细菌在短时间内大量繁殖，称为细菌的人工培养。（一）培养基培养基是人工配制的，适合细菌生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；常规高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；0.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟培养基制备的一般程序调配溶化矫正pH过滤澄清分装灭菌检定培养基灭菌★基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15分钟★含糖培养基：113℃灭菌15分钟★鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次★不耐高温的液体成分：滤过除菌保存1、选用和设计培养基的原则和方法目的明确营养协调理化条件适宜经济节约1）目的明确根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为：S10gMgSO4.7H2O0.5gNH4)2SO40.4gFeSO40.01gH2PO44gCaCl20.25gH2O1000ml培养化能异养的大肠杆菌一种培养基是由下列化学成分组成：葡萄糖5gNH4H2PO41gNaCl5gMgSO4.7H2O0.2gK2HPO41gH2O1000ml常见的培养四大类微生物的培养基细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5gH2O1000ml放线菌（高氏1号）淀粉20gK2HPO40.5gNaCl0.5gMgSO4.7H2O0.5gKNO31gFeSO40.01gH2O1000ml酵母菌(麦芽汁培养基)干麦芽粉加四倍水，在50℃--60℃保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全为止，调整糖液浓度为10。巴林，煮沸后，沙布过滤，调PH为6.0。霉菌（查氏合成培养基）NaNO33gK2HPO41gKCl0.5gMgSO4.7H2O0.5gFeSO40.01g蔗糖30gH2O1000ml2）营养协调培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4/1时，菌体量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。3）理化条件适宜pH水活度氧化还原电位a.pH培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。通常培养条件：细菌与放线菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。b.水活度在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量，一般用在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽压力之比表示，即：αw=Pw/Pow式中Pw代表溶液蒸汽压力,POw代表纯水蒸汽压力。纯水αw为1.00,溶液中溶质越多,αw越小。微生物一般在αw为0.60～0.99的条件下生长,αw过低时,微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适αw不同。c.氧化还原电位氧化还原电位又称氧化还原电势（redoxpotential），是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜；厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸,+0.1伏以下时进行发酵。4）经济节约以粗代精以野代家以废代好以国代进以简代繁以氮代朊以烃代粮以纤代糖2、培养基的类型及应用培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养分成多种类型。按成分不同划分天然培养基合成培养基含用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基化学成分完全了解的物质配制而成的培养基高氏1号培养基、查氏培养基按物理状态不同划分固体培养基液体培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.8%-2.5%琼脂含量一般为0.2%-0.8%不加任何凝固剂半固体培养基固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究按用途不同划分基础培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基用于鉴别不同类型微生物的培养基选择培养基在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化营养培养基在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长厌氧培养基高压蒸汽灭菌法Autoclaving•压力：1.05kg/cm2•温度：121.3℃•时间：15～30min•效果–杀死一切微生物，包括芽胞•耐高热、不怕潮湿的物品高压蒸汽灭菌法的注意事项包裹适中，垂直放置，留有空隙，容器开盖，勿装过满，便于流通。布类物品置于上层，瓶装液体不宜过满（不超过3/4)排尽冷气，以免影响蒸汽饱和灭菌时间达标计算，减压至零，方可取物灭菌效果，每次检测注意安全，专人监测灭菌物品，有效时间两周二、细菌的分离培养和接种技术(一)接种工具接种针和接种环：由三部分组组成，即环（针）、金属柄和绝缘柄。接种前后都要过火灭菌。接种针用于穿刺接种细菌，接种环用于固体、液体培养基的细菌接种。L型玻璃棒：用于琼脂平板涂布接种细菌。（二）接种环境操作需在接种罩、超净工作台或无菌室内进行。（三）细菌接种的基本程序灭菌接种环沾取标本接种灭菌接种环杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境细菌接种的基本程序取菌种试管和待接种的斜面试管灭菌接种环沾取标本接种接种后灭菌接种环（四）接种方法1.平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本。连续划线法：适用于含菌量较少的标本。分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环连续划线法