感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法：1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃，220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于50mlLB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注意：接种比例不得大于1:10。3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。4、4℃5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g离心5分钟；6、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。含15%甘油的0.05mol/LCaCl2制备方法:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA的状态。感受态细胞的特征：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。实验室常用的感受态细胞1.DH5α菌株克隆菌株：DH5α是一种常用于质粒克隆和高拷贝质粒的稳定复制的菌株。E.coliDH5α在使用pUC系列质粒载体转化时，其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。RecA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。基因型：F-、φ80dlacZΔM15、Δ(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-，mk+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA12.TOP10菌株克隆菌株：该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F-、mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ80、lacZΔM15、△lacⅩ74、recA1、araΔ139Δ(ara-leu)7697、galU、galK、rps、(Strr)endA1、nupG3.BL21(DE3)菌株：蛋白表达菌株：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。该菌株用于T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的acUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌株适合于非毒性蛋白的表达。基因型：F-、ompT、hsdS（rB-mB-）、gal、dcm（DE3）4.BL21(DE3)pLysS菌株蛋白表达菌株：该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型：F-、ompT、hsdS（rB-mB-）、gal、dcm（DE3）、pLysS、Camr5.Rocetta感受态特征：蛋白表达菌株Rosetta系列菌株来源于BL21系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的蛋白表达水平。（1）Rocetta（DE3）该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）对应的tRNA，这样Rocetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制，提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。tRNA基因由它们的天然启动子驱动。基因型：F-、ompT、hsdSB(rB-mB-)、gal、dcm、lacY1(DE3)、pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(Cmr)补充：稀有密码子对蛋白表达的影响：数氨基酸都有一个以上的密码子，对E.coli密码子应用情况分析表明一些密码子很少使用,尤其是精氨酸密码子AGA,AGG,CGG,CGA；异亮氨酸的密码子AUA；亮氨酸的密码子CUA和甘氨酸的密码子GGA和脯氨酸的密码子CCC很少被用到。目的基因中含有过多的稀有密码子被认为是低表达水平和产生不完全产物的一个原因。当在氨基端附近出现多个稀有密码子的时候，情况更为严重，许多研究表明，精氨酸的密码子AGA和AGG的高频出现可能大大影响蛋白的产量。当这些密码子出现在N-端附近时候，这种影响将达到最大。多个实验室报道，在宿主菌中增加同类tRNA时那些含有稀有密码子基因的蛋白产量将大大提高。RosettaTM菌株可以增加精氨酸稀有密码子AGG和AGA,异亮氨酸的密码子AUA；亮氨酸的密码子CUA和甘氨酸的密码子GGA和脯氨酸的密码子CCC。因此,很适合用于表达那些含E.coli稀有密码子基因的目的蛋白.（引用自网址）（2）Rosetta2(DE3)pLySs来源于Rosetta(DE3)，本菌株含有pRARE2质粒，除了能够提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,和GGA六个稀有密码子的tRNA外，还提供了第七个稀有密码子CGG的tRNA。同时，pRARE2质粒具有氯霉素抗性。Rosetta2(DE3)pLySs载体通过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其他大肠杆菌，能够提供更加“通用”的蛋白质表达，从而提升目的蛋白表达水平。DE3是溶源性的λDE3,所以带有T7RNA聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于pET系列载体，及其他T7启动子系列载体。含有pLSs质粒，pLySs质粒能够产生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基础表达水平。pLySs质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。pLySs质粒的起始复制位点是p15Origin,这使得该质粒能够和pUC-及pBR322-衍生的质粒互相共存。转化1、转化的原理：溶液中的Ca离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在42℃，90s热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。2、转化的步骤：（1）取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化的细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。（2）向感受态细胞中加入目的DNA（50ul感受态细胞能够被1ng超螺旋DNA所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置30min；注意：一次转化感受态细胞的建议用量为50ul，可以根据实际情况分装使用，应注意所用DNA体积不能超过感受态细胞悬液体积的十分之一，也有说法是不能超过5%。不能加入太多DNA，会影响转化效率，体积不能超过10ul，所以连接时做10ul连接体系可用一半做转化，剩下的放在4°C。（3）将离心管置于42度水浴中放置90s，然后快速转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min（一般2min），该过程不要摇动离心管；（4）向每个离心管中加入500ul无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37度摇床震荡培养45min（150rpm），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。（5）将离心管内容物混匀，可吸取适量（可吸取200-300ul，也可据情况而定）转化产物涂布平板，而如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm，2min）后，吸掉部分上清，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。注意：涂布剩余的菌液可置于4度保存，如果次日的转化菌落过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板。2、转化的注意事项：（1）感受态细胞需放置于-70°C，不可冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率；（2）进行转化操作时，应根据相应温度和无菌操作的要求进行，尽量在超净台操作；（3）为防止转化实验不成功，可以保存部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。