成都医学院卫生检验与检疫专业免疫学检验重点

免疫（immunity）：是机体对抗原性异物的识别和应答，是机体识别和消除抗原性异物的重要手段。免疫系统：由免疫器官，免疫细胞及免疫分子组成。免疫器官有：中枢免疫器官--骨髓，胸腺。外周免疫器官--淋巴结，脾脏。免疫细胞：1.淋巴细胞（Tcell,Bcell,NKcell），2.单核巨噬细胞（血液中的单核细胞和组织中的巨噬细胞），3.参与免疫应答的细胞（中性粒，嗜酸，嗜碱粒，肥大细胞）。抗体：（antibody,Ab）是体液免疫应答产生的主要效应分子，由B淋巴cell或记忆B淋巴cell经抗原刺激后增殖分化成的浆细胞产生，主要存在于血清等体液中。补体：（complement,C）是存在于血清、组织液和细胞表面的经活化后的有酶活性的蛋白质，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，故统称为补体系统细胞因子：（cytokine,CK）是细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的总称。免疫应答反应：1.固有免疫，2.适应性免疫抗原表位（epitope）:是指存在于抗原分子表面的，能与T/B细胞抗原受体或抗体特异性结合，决定抗原特异性的特殊化学基团。半抗原（hapten）：仅能与相应的抗体发生特异性结合反应，但不能单独诱导机体产生抗体。人工抗原：由大分子物质（称为载体）和半抗原组成的抗原。共同抗原表位：不同抗原之间存在的相同或相似抗原表位。共同抗原：具有共同抗原表位的不同抗原交叉反应：如果甲乙两种抗原是共同抗原，那么由甲抗原刺激机体产生的抗体，不但能够与甲抗原上相应的抗原表位发生特异性结合，而且能够和乙抗原上相同的抗原表位结合的现象。免疫球蛋白的基本结构：由两条重链和两条轻链通过二硫键结合而成的Y字形双边对称结构，称为Ig单体。可变区：在Ig近N端轻链1/2和重链1/4(γ链、α链、б链)或1/5（μ链，ε链）区域内（约110个氨基酸），氨基酸的组成和序列变化比较大。恒定区：在Ig近C端轻链1/2和重链3/4(γ链、α链、б链)或4/5（μ链，ε链）区域内，氨基酸的组成和序列在同一种属的同一类Ig中相对稳定。免疫球蛋白的水解片段：意义：1.用于研究免疫球蛋白的结构和功能。2.避免超敏反应。常用的有1.木瓜蛋白酶水解片段（将IgG分子从重链二硫键N端219位置上断裂，生成两个相同的Fab片段和一个Fc片段）。2.胃蛋白酶水解片段（将IgG分子从重链间二硫键C端232位置上断裂，形成一个F（ab'）₂片段和一些无生物活性的小分子多肽碎片pFc'片段）各类免疫球蛋白的特点：IgG：是血清和细胞外液中含量最高的Ig，唯一可透过胎盘传输给胎儿，半衰期最长（23天），出生后3个月开始合成，5岁达成人水平。IgM:是个体发育过程中最早合成和分泌的Ig（胚胎晚期开始合成），是分子量最大的Ig，血型抗体，凝集反应。IgA：分为血清型（单体），免疫作用弱和分泌型（二聚体），在黏膜局部抗感染免疫中发挥重要作用。IgD:是Bcell分化成熟的标志。lgE:是正常人血清中含量最低的Ig，参与Ⅰ型超敏反应，半衰期最短，可能与机体抗寄生虫免疫有关。抗原抗体反应的特点：1.特异性。2.比例性（在等价带前后分别为抗体过剩或抗原过剩，形成的沉淀物少或无，这种现象在免疫测定中称为“带现象”，出现抗体过量时，称为前带；抗原过剩时，称为后带）。3.可逆性。（抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素，一是抗体对相应抗原的亲和力，二是环境因素对复合物的影响）。4.阶段性。细胞破碎的方法：反复冻融法；超声破碎法；表面活性剂处理法；自溶法；溶菌酶处理法。抗原的分离和纯化：层析法：1.凝胶过滤层析；2.离子交换层析；3.亲和层析。蛋白质类载体：常用的有人血清白蛋白（HAS），牛血清白蛋白（BSA），兔血清白蛋白（RSA），牛甲状腺球蛋白（BTG）。多克隆抗体：（polyclonalantibody）是由机体的多个Bcell克隆产生的针对多个表位的混合抗体。免疫佐剂（immunaodjuvan）指同抗原一起或预先注射到机体内，能增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质，简称佐剂。作用机制：1.改变了抗原的物理形状，降低抗原在体内的分解速度，延长抗原与免疫细胞的作用时间，从而增强抗原的抗原性；2.佐剂对细胞膜有活化作用，可增加巨噬细胞和淋巴细胞的通透性，促进其对抗原的有效处理；3.直接刺激参与反应的细胞，并使之增生，扩大和增强免疫应答能力；4.促进单核/巨噬细胞活化，释放细胞因子，调节和增强淋巴细胞的应答能力。单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）：是指由一个B细胞系（克隆）所产生的抗体，仅能结合特定抗原的一个表位。单克隆抗体制备的原理：杂交瘤技术（体外细胞融合技术，获得免疫小鼠脾细胞与恶性浆细胞融合的杂交瘤细胞，能产生仅针对某一特定表位的抗体。）沉淀反应（precipitationreaction）:是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在合适条件下形成肉眼可见的沉淀物的现象。免疫浊度测定（用来定量）：分为免疫投射浊度测定和免疫散射浊度测定。单向免疫扩散试验（可定量）：原理：将一定量的抗体混在凝胶内，使待测抗原溶液在凝胶内由局部向周围自由扩散，在两者相遇并且浓度比例适当的位置出现白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。数据处理：1.Mancini曲线：适用于处理大分子抗原和长时间扩散（＞48h）的结果。2.Fahey曲线：适用于处理小分子抗原和较短时间扩散（24h）的结果。双向免疫扩散试验：原理：可溶性抗原和相应抗体在同一凝胶内都向四周自由扩散，彼此相遇而特异性结合，在两者浓度比例合适的位置形成白色沉淀线。凝集反应（agglutination）:细菌，螺旋体，红细胞等天然颗粒性抗原或者吸附于非免疫相关载体上的可溶性抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）发生特异性结合，在适当电解质存在条件下，两者比例适当时，形成肉眼可见的凝集现象。不完全抗体：lgG类抗体常会出现不完全反应，即不可见的凝集反应，这种抗体称为不完全抗体。效价（滴度titer）：进行半定量测定，即将抗体标本进行系列倍比稀释，以出现明显凝集现象的最高稀释度作为该抗体的效价或滴度。致敏：间接凝集反应试验中将抗原（或抗体）吸附或偶联在颗粒表面的过程。吸附有抗原或抗体的颗粒称为致敏颗粒。试验中所用的与免疫无关的颗粒称为载体。间接凝集反应常用载体：红细胞（人O型红细胞，绵羊红细胞）和聚苯乙烯乳胶颗粒，含有金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）的颗粒等。协同凝集试验：原理：反向间接凝集试验，但所用的载体是金黄色葡萄球菌，该菌特点：能与人及多种哺乳动物（兔，猪，豚鼠等）血清中IgG类抗体（IgG3除外）的Fc段非特异性结合。抗球蛋白试验（antiglobulintest）:又称Coombs试验，是一种抗球蛋白抗体参与的血凝试验，用于检测抗红细胞不完全体。补体结合试验的原理：参与补体结合试验的5中成分分属三个系统：1.反应系统。2.补体系统。3.指示系统（包括绵羊红细胞和相应抗体，试验时常将两者预先结合成致敏绵羊红细胞）。补体50%溶血（CH50）：在30%~70%溶血率之间，曲线最陡，几乎呈直线，补体量的微小变化就可使溶血率发生很大改变，以50%溶血为终点要比100%更敏感，该方法称为补体50%溶血。脂质体（liposome）是一种人工合成的固相载体，它是由双层脂质体组成的封闭小球，结构类似细胞，其内包有荧光素，有色染料或酶等。单个补体成分检测：1.免疫溶血法（用于功能和活性测定）2.免疫化学法（用于蛋白质含量测定）荧光标记抗体的保存：应低温，避光保存，以防止抗体失活以及荧光素的脱落和淬灭。一般用小包装-20℃以下保存，使用中防止反复冻融。荧光免疫显微技术：常见的检测标本主要有组织、细胞和细菌三种材料。按不同标本性质可制作涂片、印片或切片。荧光显微镜观察：与普通光学显微镜的不同之处在光源、滤板以及聚光器。光源：荧光物质需要一个很强的激光光源，才能保证发出良好的的荧光。滤板：按其作用分为隔热滤板、激发滤板和吸收滤板。聚光器：用以调节透光度，可选明视野聚光器或暗视野聚光器。明视野聚光器透光度大，适用于放大倍数不高的组织学切片或细胞学组织培养物的观察，其缺点是背景较亮，反差较小。暗视野聚光器的透光度小，背景暗，反差大，因此对放大倍数较高、荧光弱的标本也可进行观察。荧光免疫测定：（一）均相免疫测定（不需物理分离），（二）非均相免疫测定：1.时间分辨荧光免疫测定。2.荧光偏振免疫分析法。放射免疫分析（radioimmunoassayRIA）：是一种应用比活度高的示踪物质即放射性核素标记抗原或抗体，通过抗原与抗体反应产物来定量测定微量物质的一种免疫学分析技术，属于免疫标记技术之一。放射性碘标记抗原，标记物的鉴定--1.放射游离碘的测定。此参数是观察标记物在贮存期内脱碘程度的重要指标，结合于抗原上的放射性强度占总放射性强度一般要求大于50%。2.放射性比活度测定：比活度是指单位化学量标记物中所含的放射性强度，也可以理解为每分子被标记物平均所标记放射性原子数目。酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理：1.抗原或抗体吸附固相载体的表面，并保持其免疫活性；2.抗原或抗体与酶结合形成酶标抗原或抗体，仍然保持其免疫活性和酶催化活性，测定时，待测的抗体或抗原和酶标抗原或抗体按一定步骤与固相抗原或抗体反应。3.加入酶的底物，酶催化底物生成有色产物，有色产物的量与样品中待测抗体或抗原的量成一定比例，通过定性或定量测定有色产物量，即可确定样品中待测物质含量。固相酶免疫测定的技术要点：酶和底物的选择：常用酶：1.辣根过氧化物酶及底物。2.碱性磷酸酶及底物。3.β-半乳糖苷酶及底物。酶标记物的纯化：应用SPA与IgG结合及ConA与HRP上糖蛋白的结合进行亲和层析分离HRP标记抗体纯度更高。胶体金（colloidalgold）也称金溶液，是由金盐被还原后形成的金原子颗粒，在溶液中悬浮成胶体状。特性：1.胶体特性。2.呈色性及光吸收性。制备：最常用的方法为还原四氯金酸法，还原剂为枸橼酸钠。免疫细胞的分离和纯化：人血标本采集：采血部位：成人一般取肘静脉，婴幼儿取头皮浅静脉。常用抗凝剂：肝素，枸橼酸钠、乙二胺四乙酸（EDTA-Na₂）和氟化钠等。动物血样采集：1.颈静脉采血法（羊血标本）2.尾部采血法（大鼠或小鼠）3.眼眶动静脉采血法（大鼠或小鼠）4.心脏穿刺采血法（鼠、兔）5.动脉采血法（兔血样采集，选取兔耳中动脉）。淋巴细胞纯化：1.红细胞的去除：低渗裂解法；氯化铵裂解法。2.血小板的去除。3.单核细胞的去除：A.玻璃器皿粘附分离法：利用单核细胞具有黏附贴壁的能力，而淋巴细胞无此功能。B.吸附过滤法。C.铁粉黏附分离法：单核细胞具有吞噬和黏附羰基铁粉的能力，用磁铁吸引可将其与淋巴细胞分离。淋巴细胞亚群的分离纯化：1.E玫瑰结分离法。2.尼龙毛纤维分离法：T细胞表面绒毛短少，B细胞绒毛多而长。3.磁化细胞器分离法。免疫细胞的保存：用液氮（-196℃）保存，一般要在冻存液中加冷冻保护剂，常用的有二甲亚砜（DMSO）、甘油。细胞复苏：将冻存管自液氮中取出，立即放入37~40℃温水中快速融化。细胞活力测定：用台盼蓝染色法。T淋巴细胞功能的检测：1.T淋巴细胞增殖试验：MTT比色法：原理：活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化合物（MTT）由黄色还原为蓝黑色的甲臜。B淋巴细胞的体外检测：1.反向溶血空斑实验。2.酶联免疫斑点实验。红细胞不仅有呼吸功能，也具有一定的免疫功能。细胞因子的检测方法：1.生物学测定法。2.免疫学测定法。3.分子生物学测定法。免疫毒性：指化学、物理或生物因素作用于免疫系统后造成的免疫系统功能障碍和结构损害，也包括有害因素作用于机体其他系统后引起免疫系统的继发性损害。超敏反应（hypersensitivity）是指机体受到同一抗原再次刺激后产生的一种以生理功能紊乱或组织细胞损伤为主要表现的异常或病理性免疫应答。干扰素（IFN）：是机体受病毒或其他干扰素诱生剂刺激，由单核/巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞等产生的一组糖蛋白，具有光谱