易卒中型肾血管性高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化引起脑白质病变的机制研究

易卒中型肾血管性高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化引起脑白质病变的机制研究【摘要】目的探讨易卒中型肾血管性高血压大鼠血脑屏障紧密连接变化引起脑白质病变的机制。方法取健康清洁级雄性Wistar大鼠60只，随机分为假手术组、模型4周、8周组、12周组、20周组、30周组，每组各10只。监测血压，进行脑白质病变分级，电镜下观察白质区血脑屏障结构，免疫荧光法检测脑组织白蛋白渗出情况，Loyez染色法观察神经纤维变化。结果模型组术后各周组大鼠血压均明显高于同期假手术组大鼠血压（P0.05）；其中模型组大鼠术后4周、8周血压与术前相比血压明显升高，而术后12周、20周、30周血压趋于平稳。模型组大鼠术后8周起胼胝体病变逐渐加重，之后尾核、内囊、外囊受累病变明显加重，术后20周时胼胝体病变分级明显高于之前（P0.05）。模型12周组25个毛细血管内皮细胞紧密连接中有7个连续性中断，基底膜厚度增加；模型20周组22个毛细血管内皮细胞紧密连接中有8个连续性破坏，细胞出现明显肿胀，胞内出现空泡样病变；模型30周组19个毛细血管内皮细胞紧密连接中有10个出现中断。模型20周组大鼠胼胝体存在可吞噬白蛋白的胶质细胞；模型30周组大鼠存在颗粒状白蛋白渗出，分布于脑实质中，以胼胝体、尾核渗出最为明显。假手术组和模型4周组大鼠的Loyez神经纤维排列整齐；模型8周组大鼠的Loyez神经纤维排列出现紊乱；模型12周组可见空泡样改变；模型20周可见脑白质出现明显疏松，神经纤维断裂；模型30周组脑白质疏松更为明显。结论易卒中型肾血管性高血压大鼠模型适合于研究高血压性脑白质病变；持续高血压状态会损伤血脑屏障的毛细血管内皮细胞紧密连接，进而使血浆白蛋白渗出，引起神经毒性，导致脑白质病变的发生。【关键词】高血压性脑白质病变；血脑屏障；机制健康老年人中约14.2%存在重度脑白质病变，病理表现为小胶质细胞激活、髓鞘脱失，能够反映出人体正常衰老过程中神经退行性改变[1]。高龄和高血压为脑白质病变最重要的危险因素[2]，其中高血压可被干预但其引起脑白质病变的相关机制仍未明确。研究显示，血脑屏障受损可能与脑白质病变有关[3]。而毛细血管内皮细胞的紧密连接为血脑屏障最重要的生理结构。目前，国内外对毛细血管内皮细胞的紧密连接在高血压性脑白质病变中的改变及其诱导脑白质病变的机制研究较少，与研究脑蛋白病变的动物模型存在明显不足有关[4]。易卒中型肾血管性高血压大鼠模型的发病与人体发病过程相似度较高，且均有高血压的基础，因此本次研究选用易卒中型肾血管性高血压大鼠模型，观察不同造模时间大鼠脑白质病理学改变，旨在探讨高血压引发的毛细血管内皮细胞紧密连接损伤在高血压性脑白质病变发病中的可能机制。1材料与方法1.1实验动物健康清洁级Wistar大鼠60只，均为雄性，体重70~100g，由广西医科大学医学实验动物中心提供，合格证号：桂检字(2003)：第0005，本实验严格按照《实验动物伦理审查指南》中的规定进行。随机分为假手术组、模型4周组、模型8周组、模型12周组、模型20周组、模型30周组，每组各10只。1.2模型建立和血压测量根据已定型的双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高血压大鼠；假手术组采取未钳位夹肾动脉。在不同时间点使用BP-2000型大小鼠无创血压计（上海玉研科学仪器有限公司）经尾动脉测定大鼠收缩压。1.3脑白质病变分级使用10%的水合氯醛麻醉大鼠，剂量为400mg/kg，经左心室向主动脉插管，剪开右心房，迅速灌注150ml生理盐水，至右心房流出无血澄清液体后使用4%多聚甲醛300mL联合0.1mmol/L磷酸缓冲液固定脑组织，开颅将脑组织取出后固定1h，梯度蔗糖溶液脱水；包埋后置于冷冻切片机切片并进去HE染色。置于光学显微镜下观察脑白质病变情况，病变分级标准如下：0级：正常；Ⅰ级：神经纤维相互缠绕；Ⅱ级：有明显空泡样改变；Ⅲ级：髓鞘的神经纤维消失。1.4毛细血管内皮细胞紧密连接观察按照1.3的方法开颅取脑，取出脑白质胼胝体后立即放于固定液中。根据电镜操作标准过程制作超薄切片、半薄切片，铀铅双染后加速电压90kV条件下使用日立H-7650型透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构的变化情况。1.5脑白质白蛋白渗出检测采取间接免疫荧光法检测，先于枸橼酸中修复抗原，在室温条件下于兔血清中孵育1.5h。将血清吸干后滴加稀释过的绵羊白蛋白抗体，置于4℃环境中孵育过夜。用0.1mmol/L磷酸缓冲液洗净后，滴加兔抗绵羊二抗，避光条件下孵育1h，洗净后使用抗荧光淬灭封片液进行封片，置于荧光显微镜下观察并拍照。1.6Loyez神经纤维染色将冰冻切片置于4%的铁明矾溶液1d，蒸馏水洗5~10次，使用新配置的碳酸锂苏木素染液浸染1d，置于1%盐水乙醇分化20s，流动水清洗至返蓝为止。70%、95%、100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，封固后置于光学显微镜下观察。1.7统计学分析计量资料采用均数±标准差（sx）表示，两组间比较进行t检验，多组间比较进行方差分析，采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，以α=0.05为校验水准。2结果2.1易卒中型肾血管性高血压大鼠血压监测情况术前两组大鼠血压之间差异无统计学意义（P0.05）；术后4周、8周、12周、20周、30周时模型组大鼠血压均明显高于同期假手术组大鼠血压，差异有统计学意义（P0.05）；其中模型组大鼠术后4周、8周血压与术前相比血压明显升高，而术后12周、20周、30周血压趋于平稳。详见表1。表1易卒中型肾血管性高血压大鼠不同时间点血压变化情况（sx）分组不同时间点血压水平（mmHg）术前术后4周术后8周术后12周术后20周术后30周假手术组95.9±7.899.1±11.7106.6±8.9112.7±11.3113.1±12.4115.0±4.7模型组96.4±6.5139.2±12.7①②170.1±9.5①②190.4±14.7①196.8±15.7①208.3±12.6①注：与假手术组相比，①P0.05；不同时间点两两相比，②P0.012.2脑白质病变分级情况模型组大鼠脑白质病变分级随时间延长逐渐加重，术后4周起模型组大鼠胼胝体、尾核、内囊、外囊开始出现轻微病变，术后8周起胼胝体病变逐渐加重，之后尾核、内囊、外囊受累病变明显加重，术后20周时胼胝体病变分级明显高于之前，差异有显著统计学意义（P0.05）。另外3个区域各时间点与之前相比均无明显改变（P0.05）。详见表2。表2不同时间点脑白质病变分级情况（sx）分组胼胝体尾核内囊外囊假手术组0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0模型4周组0.5±0.10.3±0.10.3±0.20.3±0.2模型8周组0.9±0.20.5±0.10.3±0.10.3±0.2模型12周组1.5±0.11.0±0.20.3±0.20.5±0.2模型20周组2.4±0.11.6±0.10.7±0.11.0±0.2模型30周组2.8±0.11.9±0.11.4±0.11.4±0.12.3血脑屏障超微结构观察假手术组大鼠毛细血管内皮细胞间吻合、连接完整，血管形态平滑。模型4周组和8周组相邻内皮细胞紧密连接中连续且吻合紧密；模型12周组25个毛细血管内皮细胞紧密连接中有7个连续性中断，基底膜厚度增加；模型20周组22个毛细血管内皮细胞紧密连接中有8个连续性破坏，细胞出现明显肿胀，胞内出现空泡样病变；模型30周组19个毛细血管内皮细胞紧密连接中有10个出现中断。2.4脑白质白蛋白渗出检测模型4周组、模型8周组、模型12周组大鼠脑实质和血管周围未发现有血浆白蛋白渗出；模型20周组大鼠胼胝体存在可吞噬白蛋白的胶质细胞，血管附近存在增强的白蛋白荧光；模型30周组大鼠存在颗粒状白蛋白渗出，分布于脑实质中，以胼胝体、尾核渗出最为明显，血管周围白蛋白渗出少于之前。2.5Loyez神经纤维染色结果假手术组和模型4周组大鼠的Loyez神经纤维排列整齐；模型8周组大鼠的Loyez神经纤维排列出现紊乱；模型12周组可见空泡样改变；模型20周可见脑白质出现明显疏松，神经纤维断裂；模型30周组脑白质疏松更为明显。详见图1。图1神经纤维染色观察（×200）注：A：模型4周组；B：模型8周组；C：模型12周组，箭头所示为空泡样病变；D：模型20周组，箭头所示为神经纤维断裂；E：模型30周组，箭头所示为脑白质加重；F：假手术组。3讨论已有研究者选用双侧颈动脉狭窄模型对脑白质病变进行研究，但该模型与人脑白质病变过程存在较大差异，未考虑年龄、血压的影响；自发性高血压易卒中大鼠模型来源较少，高昂的成本限制了其使用[5]。为深入研究脑白质病变的发病机制，需寻找更加合适的动物模型。易卒中型肾血管性高血压大鼠多用于脑中卒相关研究，但该模型也适用于脑白质病变的研究，首先建模过程与人体慢性高血压性脑白质病变发的发病过程相似的较高，其次病理切片显示病情发展过程中出现的脑白质疏松、神经纤维缺失等病理改变与脑白质病变的病理改变一致[6]。本次研究中胼胝体为模型组大鼠病变最显著的部位，与双侧颈动脉狭窄模型一致，原因主要为：胼胝体供血的血管来源于豆纹动脉终末支，同源自大脑表面的血管间吻合度较差，当出现低灌注时胼胝体易出现缺血性改变。脑白质病变发病中高血压和高龄为两个主要的危险因素。高血压患者的脑血管阻力提升、血管自动调节能力降低与脑白质病变的严重程度密切相关[7]。本次研究显示，高血压12周前，大鼠血压快速上升未发生明显脑白质病变，12周后大鼠的血管内皮受损，经一系列病理学改变，最终出现了明显的脑白质病变。综合脑白质病变程度分级，本次研究结果支持高血压与脑白质病变存在明显关联，能够促进其发生、发展。该结果为临床中高血压患者必须将血压严格控制在合理范围内提供了依据。血脑屏障对脑内的微环境起到严格调控作用。脑白质病变患者的脑脊液白蛋白水平明显提升，而脑脊液白蛋白水平为血脑屏障受损的主要标志。血脑屏障屏障受损后，细胞因子、蛋白等大分子物质进入血管鼻、血管间隙、脑组织中引发功能性损害，可能为脑蛋白病变的发病机制[8]。本次研究显示，脑白质病变的发病过程中存在明显的白蛋白渗出，且随着病情进展渗出量呈上升趋势，能够观察到可吞噬白蛋白的胶质细胞，并且在电子显微镜下可观察到毛细血管内皮细胞的紧密连接损伤逐渐加重。进一步支持了血脑屏障损伤在脑白质病变过程中发挥一定作用。该作用可能为，血脑屏障受损时血浆中的大分子物质渗入脑组织，产生神经纤维毒性，引发脑白质病变。参考文献[1]常馨,霍世会,李晓芸等.老年脑白质病变患者认知障碍特点及危险因素[J].中国老年学杂志,2013,33(17):4324-4325.[2]JalalFY,YangY,ThompsonJ,etal.Myelinlossassociatedwithneuroinflammationinhypertensiverats[J].Stroke,2012,43(4):1115-1122.[3]UenoY,ZhangN,MiyamotoN,etal.Edaravoneattenuateswhitematterlesionsthroughendothelialprotectioninaratchronichypoperfusionmodel[J].Neuroscience,2009,162(2):317-327[4]KimCK,LeeSH,KimBJ,etal.Age-independentassociationofpulsepressurewithcerebralwhitematterlesionsinasymptomaticelderlyindividuals[J].JHypertens,2011,29(2):325-329.[5]FujitaY,LinJX,TakahashiR,etal.Cilostazolalleviatescerebralsmall-vesselpathologyandwhite-matterlesionsinstrokepronespontaneouslyhyper