开题报告改

1安徽農業大學毕业设计（论文）开题报告题目:柞蚕Serpin-1基因的鉴定与功能分析学科专业:生物化学与分子生物学研究方向:昆虫生化与分子生物学学号:14720275姓名:于慧敏指导教师:刘朝良教授合作指导老师：朱保建副教授填表日期2015年09月28日2说明1.开题报告在教研组(研究室)、专业或学科的范围内举行，须适当聘请有关专家参加。2.开题报告内容：(1)课题来源及选题依据(国内外研究动态、研究目的、意义)；(2)(3)试验设计(研究材料、方法和手段)(4)研究条件(包括原有研究基础和预备试验简况)(5)进度安排(包括论文撰写)(6)(7)3.报告内容按以上所列提纲撰写，字迹务必清楚。用16开纸书写或打印后与本页合订，一式四份，交学科专业点、所在学院、导师及研究生处各一份。4.本报告务必在第三学期内完成。3本课题的国内外研究现状（文献综述）柞蚕属于鳞翅目大蚕蛾科完全变态昆虫，是我国重要的一类绢丝昆虫。其丝在纺织业上具有广泛的应用，柞蚕可以作为生物反应器生产医用药物和有用蛋白[1]，主要应用于医药、保健品和食品等领域。脊椎动物的免疫系统主要包括先天性免疫和获得性免疫两个部分，而无脊椎动物没有像脊椎动物那样复杂的免疫系统，没有T细胞和B细胞等淋巴细胞，也不具有相关的补体系统，仅依靠先天免疫系统来抵抗外界的各种病原微生物的入侵。因此，无脊椎动物只能通过不断进化产生多样高效的防御机制，从而抵御入侵的病原微生物。无脊椎动物如昆虫的防御系统主要由两个部分组成：第一部分：坚硬的外骨骼，壳质的气管以及食膜等组成。第二道防线则是昆虫的天然免疫应答系统，包括细胞免疫应答和由昆虫的脂肪组织、中肠以及其他细胞合成分泌的免疫蛋白所引起的体液免疫应答，其是昆虫主要的应答反应途径。它们虽然不产生抗体,但可以通过产生抗菌肽类物质、抗病毒因子、蛋白酶抑制因子以及黑化反应来发挥作用。无脊椎动物血细胞能够识别病原特定的相关抗原分子，其体液免疫包括凝集系统、酚氧化酶酶原激活系统以及抗菌肽等免疫效应因子，其中酚氧化酶酶原激活系统是无脊椎动物先天免疫反应中重要组成部分，该系统由一系列蛋白酶组成，通过细胞信号级联反应最终引起宿主针对病原体的黑化作用、细胞毒性作用和吞噬作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)蛋白家族是一个成员众多、分布广泛的蛋白酶抑制剂家族。Serpin是一种单一肽链的球状蛋白质，Serpin超家族有1500多个家族成员，其大小相似，分子量为40---50kDa，由350至500个氨基酸组成，各Serpin间有一段370----390氨基酸残基的保守区，羧基末端有一个30---40氨基酸的可变区[2][3]。。在昆虫的先天免疫中，丝氨酸蛋白酶水解级联反应，可以激活导致蛋白水解的细胞因子并激活细胞内信号转到通路，从而激活家族转录因子，促进抗菌蛋白的表达。Serpin的基因表达具有组织特异性、发育阶段的特异性和诱导性。在人类中Serpin被选择来控制流程要求严格监管，如凝血、炎症和纤维蛋白溶解等。Serpin有影响先天调节途径的作用，从1980年以来，Serpin的研究在人类健康和疾病治疗方面产生很大影响。其原因大多在于Serpin具有独4特的结构即一个高度保守的核心区域、抑制机制和监管机制。目前Serpin的主要研究方向在于生物体内Serpin能与丝氨酸蛋白酶相互制约，形成一定的动态平衡，从而能够起到调节生物体内很多的生命活动[4]。研究发现大多数Serpin是作为调节因子参与生理反应.。高等生物体内Serpin可调节血液中的蛋白酶，昆虫中Serpin成员在多酚氧化酶原活化反应中具有调节作用[5]，在甲虫的体外实验已经证明，其中含有三个Serpin激活途径可以选择性地抑制三个蛋白酶级联反应。已有大量基因表达分析验证了几种Serpin在昆虫先天性免疫中的作用。MsSerpin-3在烟草天蛾幼虫血淋巴中的表达量很低，但在微生物刺激之后其表达量显著增加，它能有效抑制PAPs从而阻止proPO的激活。MsSerpin-4和MsSerpin-5在LPS刺激烟草天蛾幼虫后转录水平均增加，它们与血淋巴中丝氨酸蛋白酶MsHPl和MsHP6形成非共价复合物，在局部抑制黑化反应。MsSerpin-6基因的转录水平和蛋白质表达量在外界微生物刺激烟草天蛾幼虫后均有所增加，MsSerpin-6与丝氨酸蛋白酶MsPAP3和MsHP8形成复物抑制PPo级联，从而维持内环境的稳定，减少或避免机体或细胞的损伤。DmSerpin-43Ac可以调节成虫真菌感染的Toll途径，DmSerpin-27A可以与丝氨酸蛋白酶MsPAPl和MsPAP3形成复合物抑proPO活化控制果蝇黑化。AgSerpin-1和AgSerpin-2可以活化PPo级联，AgSerpin-2对伯氏疟原虫P.berghei的存活有剧烈影响，AgSerpin-6通过抑制proPO活化或者促使寄生虫裂解影响伯氏疟原虫P.berghei的清除，AgSerpin-10在冈比亚按蚊中肠上皮细胞的累积与疟原虫传染有关。BmSerpin-6在LPS刺激家蚕后的血淋巴和脂肪体内转录水平明显上调，由此可见，Serpin是昆虫先天性免疫的重要调节因子。2．本课题的目的及研究意义(一)课题研究目的及意义：柞蚕是我国一种重要的野外饲养的经济昆虫。相比于家蚕,柞蚕由于其种群和生长环境的特殊性使其在抗病害能力、耐气候变化能力等方面具有显著的优势,是不可替代的重要生物资源。近年来，对于柞蚕的研究相对较少，因此开展柞蚕基因功能的研究,对于通过基因柞蚕育种技术改善柞蚕丝品质,提升柞蚕市场竞争,以及利用柞蚕作为生物反应器,开发柞蚕资源的新用途等都具有十分重要的意义。而柞蚕在天然生长过程中也会遭受蚕病的影响，每年造成巨大的损失，致5病微生物给柞蚕的生长发育带来了巨大影响，观其主要原因首先病原微生物致病性强致死率高，其次是柞蚕本身作为鳞翅目昆虫只有先天免疫系统而没有获的性免疫系统，所以怎样提高柞蚕自身免疫系统抵抗病原微生物的侵害，从而提高蚕丝产量，减少损失，就成为了大家研究的重点，因此研究柞蚕先天免疫相关基因对提高柞蚕抗病能力有重要的意义。并且通过研究柞蚕免疫相关基因，也可以为其他鳞翅目昆虫的相关研究提供参考，为鳞翅目害虫的防治提供借鉴。由于丝氨酸蛋白酶抑制剂在在昆虫先天免疫中的重要作用，而目前国内外的研究主要以果蝇和烟草天蛾等模式生物为对象，而对于经济绢丝昆虫如家蚕、柞蚕的研究则比较少，通过用不同的细菌、真菌和病毒刺激柞蚕，研究探讨Serpin-1在柞蚕免疫应答反应中的作用机理，可以更加完善我们对柞蚕先天免疫的认识。从而提高柞蚕抵抗病虫害的能力，在柞蚕的饲养中能够有针对性的抵抗环境中的不利因素，为提高柞蚕免疫力及保障柞蚕养殖业的健康发展提供参考。3．本课题的研究内容与研究材料（一）课题研究内容1、柞蚕Serpin-1的克隆鉴定及结构分析2、柞蚕Serpin-1的原核表达及蛋白纯化3、多克隆抗体的制备4、柞蚕Serpin-1组织表达分布5、检测大肠杆菌、白僵菌和病毒等微生物刺激后基因的表达情况。6、筛选获得Serpin-1的相互作用蛋白并探讨其分子信号通路。4．本课题的实行方案、进度及预期效果（一）课题的实行方案：1、提取柞蚕组织RNA，并反转录成cDNA，设计特异性引物克隆出Serpin-1基因的cDNA序列并进行克隆测序,得到完整的ORF框，在NCBI上进行序列比对后，根据EST公共数据库的序列信息，对其进行生物信息学分析2、设计带酶切位点引物，将Serpin-1序列分别与pet28a和pgex载体进行双酶切，然后分别构建原核表达载体pet28a-Serpin-1和pgex-Serpin-16将其转入大肠杆菌DH5a和BL21DE3。用不同浓度IPTG诱导其进行表达。并通过SDS-PAGE电泳和Westernblot检测其表达情况。3、其中连接pet28a载体表达后用于制备多克隆抗体,纯化后蛋白浓度经BCA定量后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.连接pgex载体用于诱导可溶性蛋白，用于后续实验做蛋白的功能。4、利用实时定量PCR和Westernblot对五龄3天的柞蚕幼虫的表皮、丝腺、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢、血细胞、血淋巴中Serpin-1的转录、翻译的蛋白表达情况进行检测5、分别设置时间点4、8、12、24从柞蚕中取组织，用实时定量PCR和Westernblot检测病原微生物刺激过后Serpin-1的转录和表达情况。6、进行GSTpull-down实验，筛选出互作蛋白。通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”。“诱饵蛋白”即我们的Serpin-1纯化过后的蛋白，捕获蛋白则是进行GSTpull-down实验后捕获的可以与诱饵蛋白相互作用的蛋白。将Serpin-1-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后，通过SDS-PAGE电泳进行分析,从而得到蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，并进行其信号通路的研究。使用不同刺激物刺激柞蚕，分析Serpin-1在受刺激后表达的变化，并分析筛选得到的与Serpin-1蛋白相互作用的目的蛋白的表达是否发生变化，从而探讨出Serpin-1与其相互作用的蛋白在柞蚕免疫信号通路中的作用。（二）研究进度：2014.9-2014.12收集资料、阅读文献。2015.1-2015.6完成Serpin-1克隆，原核表达及蛋白纯化。2015.7-2016.4完成抗体制备，不同微生物刺激实验。2016.5-2016.12互作蛋白筛选及信号通路分析，撰写投稿论文。2017.1-2017.6补充实验，完成论文，参加答辩。（三）预期效果：71、成功表达并获得重组Serpin-1蛋白，并制备多克隆抗体。2、Serpin-1在各组织中的分布具有差异性，在免疫相关组织中表达量高。3、不同病原微生物免疫刺激后该基因及蛋白的表达水平明显发生变化4、筛选获得Serpin-1互作蛋白,初步明确柞蚕Serpin-1在先天免疫中的作用。5、发表SCI论文一篇。5.技术路线5、已查阅参考文献1.向仲怀，杨焕明。2003.家蚕基因组研究对蚕业学科和产业发展的影响。世界科技研究与发展：25（6）：1-42.戚正武。丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构与功能[J]．生物化学与生物物理进展，1998，15(5)：322—3293.王菲,李亚明,化晓婷,夏庆友。家蚕免疫稳态调控分子的鉴定和表达模式分析[J].昆虫学报.2012(09)4.姚国华,钟伯雄,颜新培,沈飞英,陈齐龙,周丽,童小芬。家蚕胚胎发育关联8的初始蛋白质研究[J].蚕业科学.2004(04)5.许平震。家蚕先天免疫的模式识别、信号传导和抗微生物肽基因表达调控机制研究[D].西南大学20106.吴家红,蚊虫唾液组分的抗凝血活性及其对宿主的免疫调控作用[J].中国媒介生物学及控制杂志2008,19（5）：481-4837.李玉欣，亓希武,韩琦,等。家蚕丝氨酸蛋白酶BmHP14基因的克隆与表达模式分析[J].蚕业科学,2012,38(5):0814-0821.8.陈文柱,李兵,贡成良,等。酚氧化酶在家蚕血淋巴中的活力分布及影响因素的研究[J].江苏蚕业,2005,27(2):12–159.张永亮,朱勇。家蚕变态期酚氧化酶原基因PPO1的表达谱分析[J].蚕业科学,2008,34(4):741-74410.吴载德，蚕体解剖生理学学[M].北京:农业出版社,1993:201-20311.宁媛媛，尤民生,王成树，2009，昆虫免疫识别与病原物免疫逃避机理研究进展.昆虫学报，52(5):567－57512.查宏贤,刘罡,张晨,等.家蚕丝氨酸蛋白酶抑制4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备[J].昆虫学报,2011,54(6):642－64713.陶美林,潘国庆,胡怀翠,等.家蚕微孢子虫丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白s