引物纯化方式HAPPAGEDHLPC的区别

引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC等的区别纯化方式：一OPC纯化OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反向层析柱（美国Waters公司生产),根据DNA保护基(DMTr基)和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于90%，适用于PCR用引物，DNA测序用引物，各种探针等。此级别对短链较为有效。具体操作方法如下。1.DNA合成是用全自动DNA合成仪从3‘→5‘进行人工合成的。在刚合成完的DNA的5‘端的碱基上带有一个大型的疏水性保护基团DMTr基，而中间产物的短链杂质DNA中不具有DMTr基。利用这一性质进行目的DNA的纯化。2.把粗样DNA加入Sep-PakCartridge柱上（简易反相柱)。此时，所有的合成产物全吸附于反相柱上。3.用甲醇清洗反相柱。此时，吸附能力强的带有DMTr保护基的目的DNA仍吸附于反相柱上，而短链杂质DNA片段全部被冲走。4.向反相柱上加入强酸TFA(Trifluoroaceticacid),切断DMTr保护基和目的DNA之间的连接。5.再用乙腈洗脱目的DNA。此时回收出来的目的DNA的纯度能达到95%以上。可用于DNA测序等。二PAGE纯化PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的纯度大于95%，对长链OligoDNA的纯化特别有效。适用于PCR用引物，DNA测需用引物，各种探针等。三HPLC纯化采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。适用于各种基因工程试验，特别是：荧光标记DNA、长链DNA、PCR克隆，定点突变，人工合成基因等。HPLC纯化HPLC纯化是使用高效液相色谱仪，对目的DNA片段进行纯化的方法。HPLC纯化的设备投资大，生产成本高，但使用本法纯化的DNA片段纯度极高，大于99%。HPLC纯化的操作方法如下。1.合成高纯度级DNA制品时，在全自动DNA合成仪上，需自动脱去DMTr保护基。2.将粗样DNA注入分离性能极强的离子交换高效液相色谱系统，进行粗检测，确认主峰位置、目的DNA含量等。3.增加注样量，回收主峰平头部分。此时可达到去除杂质短链DNA，纯化目的DNA的目的。为了确保DNA的纯度，一般一次的纯化量为1OD左右。4.将回收后的DNA进行纯度检测，确认纯度的可靠性。四HAP什么是HAP？HAP是英文HIGEAFFINITYPURIFICATIION的缩写。HAP方法是生工自主开发的新型oligoDNA纯化方法。。用HAP纯化的引物纯度可达98%以上，完全可与PAGE、HPLC方法媲美。其原理是利用合成引物5’-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附、而不含DMT的短链DNA不被吸附，从而达到分离纯化的目的。HAP方法的三大优势：纯度高。用其纯化所得引物的纯度高达98%以上(见图1)。可用于绝大多数分子生物学实验。快速。用HAP方法纯化的引物一轮只需2小时，因而可比PAGE方法提前一天交货，节约您更多宝贵时间。价格上更有竞争优势。由于HAP方法与PAGE、HPLC方法相比速度快、成本低，从而节约科研经费。HAP引物的用途用HAP方法纯化的引物可用于绝大多数分子生物学实验，包括DNA测序、基因合成、PCR反应、点突变、分子杂交和基因芯片技术等。其纯度对于一般的PCR实验而言更是绰绰有余。从2000年起，生工测序部和基因合成部所用引物均来自HAP方法。目前基因合成部更是每周需要HAP纯化的引物至少2000条。事实证明，HAP方法纯化的引物完全可以用于测序反应和基因合成等对引物纯度要求较高的实验。五RPC纯化RPC纯化是通过反相净化滤芯(ReversePhaseCartridge)对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、PCR及基因合成等。根据纯化方式的不同，DNA制品可分为三个级别：OPC级、PAGE级、高纯度级。OPC级制品：进行OPC纯化，纯度大于95%。适用于PCR用引物、DNA测序用引物、各种探针等。此级别只接受30mer以下的制品。PAGE级制品：用PAGE胶纯化，纯度大于95%。适用于PCR用引物、DNA测序用引物、各种探针等。纯化30mer以上的合成DNA制品时，纯度高于OPC纯化法。高纯度级制品：采用高效液相色谱（HPLC）法进行纯化，纯度大于99%。由于纯度极高，使用本法纯化的DNA制品可适合于各种基因工程实验。特别是：PCR克隆、定点突变、人工合成基因等引物纯化方式建议合成的引物纯度高且反应不完全的短链少，应用于PCR扩增、DNA测序以及基因合成等的实验，无需进一步纯化。但未进一步纯化的引物始终含有合成和脱保护不完全的产物、合成不正确的引物以及在合成后处理中从碱基上切割下来的保护基团，因而是否需要进一步纯化取决于对副产物占最终产物大概比例的评估以及这些副产物对客户后续实验的影响程度。通常而言，引物进一步纯化主要起到三个方面的重要作用：1.从最终产物（nmer）中去除反应不完整的短链引物（n-1mer,n-2mer等）；2.去除引物合成反应中的副产物；3.去除从碱基上切割下来的保护基团。引物纯化方式有很多种,目前常见的几种引物纯化方式，如C18柱脱盐、RPC纯化、ePAGE纯化、PAGE纯化及HPLC纯化等。表1即对以上几种纯化方式进行了一一介绍采用RPC、ePAGE、PAGE、HPLC几种纯化方式，在选择上主要根据引物的长度和应用方面对纯度的要求而定，表2即从引物长度的角度总结了以上每一种纯化方法的适用范围。您可根据实验需要，选择合适的引物纯化方式。